本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、暹羅炭疽菌(colletotrichum?siamense)是一種危害嚴(yán)重的土傳病原真菌，被列為世界十大植物病原真菌之一。尤其是在亞熱帶和熱帶地區(qū)，暹羅炭疽菌可導(dǎo)致多種水果、蔬菜和觀賞植物的腐爛和炭疽病，對農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。暹羅炭疽菌傳染性極強(qiáng)，病程發(fā)展迅速，因此對其進(jìn)行早期、特異性和準(zhǔn)確的鑒定是有效控制病害的關(guān)鍵。目前，鑒定暹羅炭疽菌的主要方法是形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)法等。其中形態(tài)學(xué)方法需要具備充分的專業(yè)知識(shí)，對于不常見的病害可能會(huì)判斷失誤；培養(yǎng)法是目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)太長；pcr法(包括熒光定量pcr法)需要專業(yè)pcr儀器，操作復(fù)雜，難以在基層應(yīng)用；lamp法雖然不需要昂貴的儀器，反應(yīng)快速，但容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和交叉污染，造成假陽性結(jié)果。因此，目前仍急需一種手段可以實(shí)現(xiàn)暹羅炭疽菌的快速準(zhǔn)確檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在提供一種快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，能夠節(jié)約檢測時(shí)間，操作簡便。

2、本發(fā)明還提供了一種快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒的應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，包括引物組、bst?dna聚合酶、dntp?mix、cas12b核酸酶、sgrna、mgso4、反應(yīng)緩沖液、牛磺酸、攜帶熒光報(bào)告基團(tuán)的單鏈寡核苷酸探針。

4、進(jìn)一步地，所述引物組的核苷酸序列如seq?id?no.1-6或seq?id?no.7-12所示。

5、進(jìn)一步地，所述sgrna序列如seq?id?no.13-15任一所示。

6、作為優(yōu)選，所述sgrna序列如seq?id?no.15所示。

7、進(jìn)一步地，所述攜帶熒光報(bào)告基團(tuán)的單鏈寡核苷酸探針序列為5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

8、其中，所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒在快速檢測暹羅炭疽菌dna中的應(yīng)用。

9、進(jìn)一步地，所述試劑盒檢測過程為：

10、s1：配制反應(yīng)混合物；

11、s2：向s1的反應(yīng)混合物中加入1-2μl樣品模板，充分混勻后，放入可加熱的熒光儀中反應(yīng)，如果熒光信號明顯增加，則表明樣品中含有暹羅炭疽菌dna。

12、進(jìn)一步地，所述s1中反應(yīng)混合物包括：20-30u?bst?dna聚合酶、50-300nmol?dntp、200-400nmol?mgso4、lamp引物組、2-4pmol?cas12b核酸酶、280-285ng/μl?sgrna、21-26pmol單鏈熒光探針、牛磺酸、反應(yīng)緩沖液。

13、作為優(yōu)選，所述s1中反應(yīng)混合物包括：3μl?bst?dna聚合酶(8u/μl)、7μl?dntp(10mm?each)、4μlmgso4(100mm)、5μl?lamp引物預(yù)混液(1.6μm?fip/bip、0.2μm?f3/b3、0.8μm?lb/lf)、3μl?cas12b核酸酶(1μm)、1μl?sgrna(280ng/μl)、5μl單鏈熒光探針(5μm)、5μl?；撬?500mm)、5μl?10×反應(yīng)緩沖液。

14、進(jìn)一步地，所述s2反應(yīng)條件為55-60℃下反應(yīng)30-35min。

15、進(jìn)一步地，所述s1配制及保存條件為2-4℃。

16、本發(fā)明的技術(shù)原理是通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)反應(yīng)快速擴(kuò)增暹羅炭疽菌dna，而特異性sgrna與擴(kuò)增產(chǎn)物完美配對后，會(huì)激活cas12b的反式切割活性，切割單鏈寡核苷酸探針，從而釋放熒光信號基團(tuán)，發(fā)出熒光信號。lamp所用bst?dna聚合酶和cas12b核酸酶在60℃下均具有良好活性，可以同步反應(yīng)。

17、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

18、本發(fā)明提供了用于lamp擴(kuò)增暹羅炭疽菌dna的特異性引物組和crispr/cas12b檢測的sgrna。同時(shí)，本發(fā)明提供的試劑盒具有很好的特異性和靈敏度，操作方便，檢測時(shí)間短，僅在30min內(nèi)就可以快速區(qū)分出暹羅炭疽菌和其他病菌，結(jié)果判讀簡單準(zhǔn)確，適合基層檢測使用。

技術(shù)特征：

1.一種快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括引物組、bstdna聚合酶、dntpmix、cas12b核酸酶、sgrna、mgso4、反應(yīng)緩沖液、?；撬帷y帶熒光報(bào)告基團(tuán)的單鏈寡核苷酸探針。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，其特征在于，所述引物組的核苷酸序列如seq?id?no.1-6或seq?id?no.7-12所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，其特征在于，所述sgrna序列如seq?id?no.13-15任一所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，其特征在于，所述sgrna序列如seq?id?no.15所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒，其特征在于，所述攜帶熒光報(bào)告基團(tuán)的單鏈寡核苷酸探針序列為5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

6.一種權(quán)利要求1所述快速檢測暹羅炭疽菌dna的試劑盒在快速檢測暹羅炭疽菌dna中的應(yīng)用。

7.據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒檢測過程為：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述s1中反應(yīng)混合物包括：20-30u?bst?dna聚合酶、50-300nmol?dntp、200-400nmol?mgso4、lamp引物組、2-4pmol?cas12b核酸酶、280-285ng/μl?sgrna、21-26pmol單鏈熒光探針、牛磺酸、反應(yīng)緩沖液。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述s2反應(yīng)條件為55-60℃反應(yīng)30-35min。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述s1配制及保存條件為2-4℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于檢測暹羅炭疽菌DNA的試劑盒及其應(yīng)用。所述試劑盒包括引物組、Bst?DNA聚合酶、dNTP、Cas12b核酸酶、sgRNA、MgSO<subgt;4</subgt;、反應(yīng)緩沖液、牛磺酸、攜帶熒光報(bào)告基團(tuán)的單鏈寡核苷酸探針。所述特異性引物組的核酸序列如SEQ?IDNo.1?6或SEQ?ID?No.7?12所示，所述sgRNA的核酸序列如SEQ?ID?No.13?15所示。本發(fā)明建立并優(yōu)化了針對該暹羅炭疽菌的CRISPR/Cas12b檢測體系。該檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便快捷，能在30分鐘內(nèi)完成檢測，更適合基層推廣和應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：唐冬蘭,田亞茹,羅志丹,曹榮祥,盧辰,陳佳玥,張丹,英新宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2