本發(fā)明屬于生物，具體涉及msmcu1.2蛋白及其相關(guān)生物材料在培育抗凍植物品種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紫花苜蓿是一種重要的多年生豆科牧草，廣泛種植于全球各地，主要用于牧草和飼料，并以其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、適口性好、固氮能力強(qiáng)、生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在不同溫度區(qū)廣泛種植。然而，苜蓿的生長(zhǎng)和生產(chǎn)受多種環(huán)境脅迫的影響，其中低溫脅迫是限制苜蓿生長(zhǎng)和生產(chǎn)的重要因素之一。在極端的環(huán)境條件下，冷凍脅迫是削弱苜蓿生長(zhǎng)、發(fā)育、生產(chǎn)力和分布的主要因素，尤其是在北方寒冷地區(qū)。此外，異常的溫度突變?cè)诙竞碗S后的春季霜凍事件中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。寒冷的環(huán)境不僅會(huì)影響苜蓿的生長(zhǎng)速度，還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生理損傷甚至植物死亡，從而嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。

2、傳統(tǒng)上，通過選育耐寒性強(qiáng)的品種是提高紫花苜蓿耐寒性的主要手段。然而，這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且受到遺傳背景和環(huán)境因素的限制。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為紫花苜蓿耐寒性的改良提供了新的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物耐寒性，培育抗凍植物品種。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了msmcu1.2蛋白的新用途。

3、本發(fā)明提供了msmcu1.2蛋白在如下a1)-a3)任一種中的應(yīng)用：

4、a1)調(diào)控植物耐逆性；

5、a2)培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物；

6、a3)植物育種；

7、所述msmcu1.2蛋白為如下b1)-b4)中的任一種：

8、b1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；

9、b2)在序列2所示的氨基酸序列的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)；

10、b3)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

11、b4)與序列2所示的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

12、上述b2)所述蛋白質(zhì)中，所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白質(zhì)，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、his6標(biāo)簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、gfp(綠色熒光蛋白)、cfp(青色熒光蛋白)、yfp(黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。

13、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽為3×flag標(biāo)簽蛋白。所述融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列3所示。

14、上述b3)所述蛋白質(zhì)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

15、上述b4)所述蛋白質(zhì)中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟?guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambdaratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索一對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。所述同一性包括與本發(fā)明的序列2所示的氨基酸序列具有80％或更高，或具有85％或更高，或具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

16、上述b1)-b4)所述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

17、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與上述msmcu1.2蛋白相關(guān)的生物材料的新用途。

18、本發(fā)明提供了與上述msmcu1.2蛋白相關(guān)的生物材料在如下a1)-a3)任一種中的應(yīng)用：

19、a1)調(diào)控植物耐逆性；

20、a2)培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物；

21、a3)植物育種；

22、所述生物材料為編碼所述上述msmcu1.2蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物；

23、上述應(yīng)用中，所述核酸分子為下述任一種：

24、f1)序列1所示的dna分子；

25、f2)與f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上的同一性，并且編碼上述msmcu1.2蛋白的dna分子。

26、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

27、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼msmcu1.2蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼msmcu1.2蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼msmcu1.2蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

28、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

29、上述75％或75％以上同一性，可為80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。

30、上述應(yīng)用中，所述表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)msmcu1.2蛋白的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)msmcu1.2轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止msmcu1.2轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv?35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。

31、上述應(yīng)用中，所述載體是指能夠把上述核酸分子運(yùn)載進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的載體，所述載體可以是克隆載體也可以是表達(dá)載體，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體(如λ噬菌體或m13絲狀噬菌體等)、黏粒(即柯斯質(zhì)粒)、ti質(zhì)粒、病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒等)。

32、所述重組載體是指將上述核酸分子與所述載體在體外連接構(gòu)建而成的重組dna分子?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述msmcu1.2基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

33、上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。所述細(xì)菌具體可為農(nóng)桿菌，如根癌農(nóng)桿菌lba4404。

34、所述重組微生物是指對(duì)目的微生物的基因進(jìn)行操作和修飾，從而得到功能發(fā)生變化的重組微生物。如將上述重組載體導(dǎo)入目的微生物后得到的重組微生物。所述重組微生物可理解為不僅是指特定的重組微生物，而且也指這種細(xì)胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細(xì)胞完全一致，但仍包括在重組微生物的范圍中。

35、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性。所述提高植物耐逆性體現(xiàn)為：當(dāng)植物中msmcu1.2蛋白的含量和/或活性提高時(shí)，植物的耐逆性提高。

36、進(jìn)一步的，所述提高植物耐逆性為提高植物耐寒性。

37、更進(jìn)一步的，所述提高植物耐寒性具體體現(xiàn)為：當(dāng)植物中的msmcu1.2基因表達(dá)量提高時(shí)，植物在冷凍脅迫后的存活率提高。

38、上述應(yīng)用中，所述植物育種的目的為培育耐逆植物品種(如抗凍植物品種)。

39、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

40、本發(fā)明提供的培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：提高目的植物中上述msmcu1.2蛋白的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

41、上述方法中，所述耐逆性為耐寒性。

42、進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物體現(xiàn)為所述轉(zhuǎn)基因植物在冷凍脅迫后的存活率高于所述目的植物。

43、更進(jìn)一步的，所述冷凍脅迫的條件可為-10℃處理1.5h。

44、上述方法中，所述提高目的植物中上述msmcu1.2蛋白的含量和/或活性的方法為在目的植物中過表達(dá)上述msmcu1.2蛋白。

45、進(jìn)一步的，所述過表達(dá)的方法為將上述msmcu1.2蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏小?/p>

46、更進(jìn)一步的，所述msmcu1.2蛋白的編碼基因的核苷酸序列如序列1所示。

47、上述任一應(yīng)用或方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述msmcu1.2基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

48、上述任一應(yīng)用或方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；進(jìn)一步的，所述雙子葉植物可為豆科植物和/或十字花科植物；更進(jìn)一步的，所述豆科植物可為苜蓿(如紫花苜蓿)；所述十字花科植物可為擬南芥(如哥倫比亞生態(tài)型col-0)。

49、本發(fā)明通過在野生型擬南芥中過量表達(dá)msmcu1.2，得到msmcu1.2超量表達(dá)擬南芥，并通過對(duì)msmcu1.2超量表達(dá)擬南芥進(jìn)行耐寒性分析后發(fā)現(xiàn)：過量表達(dá)msmcu1.2可以提高植物耐寒性。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)msmcu1.2蛋白及其相關(guān)生物材料可調(diào)控植物耐寒性，將在培育抗凍植物品種中發(fā)揮重要的作用。