本公開總體上涉及一種細胞培養(yǎng)基配方以及用于在培養(yǎng)中的細胞的病毒繁殖和增殖的方法，特別是用于生產(chǎn)疫苗。具體來講，本公開提供了有助于促進用于禽類疫苗生產(chǎn)的初代或次代細胞培養(yǎng)物體外培養(yǎng)的無血清的確定的細胞培養(yǎng)基配方，其中生長培養(yǎng)基包含素食(vegetarian?diet)。此外，本公開提供了使用無血清生長培養(yǎng)基進行在培養(yǎng)中的細胞的病毒繁殖和增殖的方法。本公開的培養(yǎng)基特別適合于成纖維細胞，例如雞胚成纖維細胞的貼壁培養(yǎng)。

背景技術(shù)：

1、大多數(shù)病毒疫苗是通過細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來生產(chǎn)的。在基于細胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)中，病毒產(chǎn)量至關(guān)重要，不僅因為更高的病毒產(chǎn)量使得更多的疫苗生產(chǎn)更快，而且因為這對于確定基于細胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)方法的經(jīng)濟可行性是重要的。

2、用于病毒/疫苗生產(chǎn)的細胞可以是細胞系或原代動物。雞胚成纖維細胞(cef細胞)是用于病毒生產(chǎn)的原代細胞的一個例子。減毒病毒通常在cef細胞培養(yǎng)中繁殖。體外細胞生長和繁殖需要培養(yǎng)條件，其包括可以支持細胞生長和繁殖的培養(yǎng)基。一般來說，用于培養(yǎng)哺乳動物來源的細胞所常用的細胞培養(yǎng)基包含富鹽溶液，其含有維生素、氨基酸、必需微量元素和糖。另外，細胞生長所需的生長激素、酶和生物活性蛋白，通常以動物血來源的血清或可替代地從動物血來源的血清中分離出的蛋白質(zhì)組分的形式作為補充劑而添加。

3、動物血來源的血清制品的實例是胎牛血清、雞血清、馬血清和豬血清。這些血清來源于分級分離(fractionated)的血液，其中已經(jīng)去除了紅細胞和白細胞。原代細胞，比如cef細胞甚至比細胞系更依賴于動物血清來源。因此，原代細胞通常在含有5％至10％血清的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，多數(shù)情況下該血清為胎牛血清(fcs)。

4、動物血來源的血清制品可能含有外源性致病因子，例如病毒或朊蛋白。這些病原體可能會傳播給待用疫苗或任何其他在補充有血清的細胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的藥物制品來治療或接種的動物/人類，由于該潛在風險，由此也引發(fā)了使用血清的安全擔憂。常用的牛血清補充劑例證了這些擔憂，其中與其使用相關(guān)的許多主要問題/風險之一是將引起牛海綿狀腦病(bovine?spongiform?encephalopathy，bse)的因子傳播給與從使用牛血清補充劑的細胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的制品/疫苗接觸的動物/人類的可能性。因此，使用無血清培養(yǎng)基是有優(yōu)勢的，以去除血清中的污染物，比如病毒或致病性朊蛋白，其一定不能留在例如重組蛋白或病毒疫苗載體的最終制品中。

5、考慮到與在細胞培養(yǎng)中使用動物血清相關(guān)的可能風險，開發(fā)不含任何動物來源的蛋白質(zhì)或肽的無血清培養(yǎng)基顯然會是優(yōu)選。具體來說，用從非動物來源分離的蛋白質(zhì)、肽或脂類來替代動物來源的蛋白質(zhì)或肽，將減少與血清相關(guān)的安全擔憂。

6、因此，仍然需要改善無血清疫苗生產(chǎn)的策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本公開提供了無血清培養(yǎng)基，其能培養(yǎng)大范圍的懸浮和單層細胞，同時能夠支持禽類疫苗生產(chǎn)。

2、本公開提供了無血清培養(yǎng)基，其包含各種無機鹽、碳水化合物、氨基酸、緩沖劑、維生素和化合物以模擬自然細胞環(huán)境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、鹽類、維生素和化合物中的許多可從不含蛋白質(zhì)或生長促進劑的市售合成培養(yǎng)基中獲得，例如emem或dmem。

3、本公開提供了無血清培養(yǎng)基，其包含源自植物或蔬菜來源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。

4、此外，本公開還提供了使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞和細胞系用于病毒繁殖和增殖的方法。

5、發(fā)明詳述

6、本公開的一個目的是開發(fā)一種無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基能培養(yǎng)大范圍的懸浮和單層細胞，同時能支持禽類疫苗生產(chǎn)。

7、本公開的培養(yǎng)基還包括各種無機鹽、碳水化合物、氨基酸、緩沖劑、維生素和化合物以模擬自然細胞環(huán)境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、鹽類、維生素和化合物中的許多可從不含蛋白質(zhì)或生長促進劑的市售合成培養(yǎng)基中獲得，例如emem或dmem。除了上述的血清替代品之外，還可以向培養(yǎng)基中添加各種額外的氨基酸、鹽類、碳水化合物、維生素和化合物，比如酵母提取物和抗生素，以組成本公開的完全無血清培養(yǎng)基。

8、本公開的另一個目的涉及使用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞和細胞系用于病毒繁殖和增殖的過程。無血清培養(yǎng)基包括源自植物或蔬菜來源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。

9、本公開提供了一種在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細胞，特別是原代禽類細胞的方法，以及在無血清條件下在原代細胞中生產(chǎn)病毒的方法。用于培養(yǎng)原代細胞的本發(fā)明方法的特征可在于在補充有源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。

10、注意，在本公開中，尤其是在權(quán)利要求中，術(shù)語比如“包含”、“包含”、“包含”等可以意為“包括”、“包括”、“包括”等。術(shù)語“基本上由...組成”和“基本上由...組成”允許存在未明確表述的元件，但排除現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明的基礎的或新型的特征的元件。

11、除非明確說明，技術(shù)術(shù)語按照慣例使用。分子生物學中常見術(shù)語的定義見于牛津大學出版社1994年出版的由benjamin?lewin編寫的《genes?v》(isbn?0-19-854287-9)，blackwell?science?ltd?1994年出版的由kendrew等人編寫的《the?encyclopedia?ofmolecular?biology》(isbn?0-632-02182-9)以及由vch出版商1995年出版的由roberta.meyers編寫的《molecular?biology?and?biotechnology:a?comprehensive?deskreference》(isbn?1-56081-569-8)。

12、除非上下文另有明確說明，單數(shù)名詞“一”、“一個”和“該”包括復數(shù)指代。類似地，除非上下文另有明確說明，“或”一詞旨在包括“和”?！盎颉币辉~指特定列表中的任何一個成員，也包括該列表中成員的任何組合。

13、本文中使用的術(shù)語“原代細胞”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。不受限于以下定義，術(shù)語“原代細胞”可以指已經(jīng)從動物或人類組織、器官或生物體中新鮮分離的細胞，其中細胞不能連續(xù)且無限地復制和分裂。通常情況下，原代細胞在細胞培養(yǎng)中分裂少于100次，經(jīng)常是少于50次，經(jīng)常是少于25次。因此，原代細胞沒有經(jīng)歷永生化事件。原代細胞的例子是動物成纖維細胞，例如但不限于雞胚成纖維細胞(cef細胞)。分離原代細胞的方法是眾所周知的。通常情況下，原代細胞培養(yǎng)物是通過使用蛋白酶處理組織、器官或胚胎以獲得單細胞而直接源自組織、器官或胚胎的。

14、本公開的方法不局限于形成單層的細胞。根據(jù)一個替代實施方案，本公開中的方法可以用于所有其他類型的原代細胞，比如自然生長于懸浮培養(yǎng)的細胞(例如淋巴細胞或其他類型的血細胞)或自然將作為貼壁細胞生長但已經(jīng)適應在懸浮培養(yǎng)中生長的細胞。

15、如下所示，細胞也可以用于可作為疫苗而有用的病毒的無血清擴增。

16、一般來說，用作疫苗的病毒，包括野生型病毒、減毒病毒和重組病毒，是在含血清的條件下生長和擴增的。然而如上所述，存在血清含有致病因子可能傳播給用疫苗治療或接種的動物/人類的潛在風險。為了減少疫苗中污染物的風險，本公開的另一個方面是在無血清條件下傳代和/或培養(yǎng)那些前期已經(jīng)在含血清條件下增殖并計劃用作疫苗的病毒。

17、出乎意料的是，自然作為貼壁細胞生長的原代細胞可以有效地附著于細胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成不可接受量的聚集體，并且可以在不存在血清的情況下在對數(shù)期生長，因為通常認為原代細胞依賴于血清中包含的多種不同因子和組分。此外，通常認為在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，貼壁細胞形成不存活的聚集體，其不附著于細胞培養(yǎng)容器的表面。由此，出乎意料的是，足以用源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨補充無血清培養(yǎng)基以獲得貼壁原代細胞的附著和生長。此外，還出乎意料的是，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)的原代細胞可以用根據(jù)本公開的方法中所用的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

18、特別地，令人驚訝的是，原代禽類細胞，例如本發(fā)明的雞胚成纖維細胞(cef)，在補充有源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨的無血清培養(yǎng)基中可被培養(yǎng)以附著在細胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成不可接受量的細胞聚集體。然而，人們理解在不包含血清中發(fā)現(xiàn)的生長因子或附著因子的無血清培養(yǎng)基中禽類細胞生長不利，即令人意想不到的是，通過在無血清培養(yǎng)基中補充來自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨，可以顯著改善原代禽類細胞較差的生長特征。

19、在貼壁原代細胞的上下文中術(shù)語在無血清培養(yǎng)基中進行“細胞培養(yǎng)”指的是將細胞接種于培養(yǎng)容器在無血清培養(yǎng)基中，在無血清培養(yǎng)基中細胞在對數(shù)期生長直到形成單層和/或形成單層后在無血清培養(yǎng)基中細胞的維持。術(shù)語在無血清培養(yǎng)基中進行“細胞培養(yǎng)”也指上述所有步驟是在無血清培養(yǎng)基中進行的方法，從而在整個細胞培養(yǎng)過程中不存在動物血清制品。因此，從更普遍的意義上來說，術(shù)語“在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞”指的是在形成單層的過程中所有的培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。上述所有步驟中使用的培養(yǎng)基可以補充有源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨。

20、在懸浮培養(yǎng)中生長的細胞的上下文中術(shù)語在無血清培養(yǎng)基中進行“細胞培養(yǎng)”指的是將細胞接種于培養(yǎng)容器中在無血清培養(yǎng)基中，在無血清培養(yǎng)基中細胞在對數(shù)期生長和/或達到復制不再發(fā)生的飽和密度后在無血清培養(yǎng)基中細胞的維持。術(shù)語在無血清培養(yǎng)基進行“細胞培養(yǎng)”指上述所有步驟都是在無血清培養(yǎng)基中進行的方法，從而在整個細胞培養(yǎng)中不存在動物血清制品。上述所有步驟中使用的培養(yǎng)基可以補充有源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨。

21、術(shù)語“無血清”培養(yǎng)基指的是不包含來自動物或人源的血清的任何細胞培養(yǎng)基。合適的細胞培養(yǎng)基對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。這些培養(yǎng)基包含鹽類、維生素、緩沖液、碳水化合物、氨基酸以及其他化合物，比如酵母提取物和抗生素。

22、根據(jù)本公開的方法使用的培養(yǎng)基，特別是用于諸如cef細胞的貼壁細胞的培養(yǎng)基，包含源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨。肽和蛋白胨的例子是蔬菜胰蛋白胨。

23、無血清培養(yǎng)基還可以包括一種或多種選自微生物提取物、植物提取物和來自非哺乳類動物的提取物的添加劑。微生物提取物可以是酵母提取物或酵母粉超濾液(yeastolate?ultrafiltrate)。植物提取物可以是大米提取物或大豆提取物。來自非哺乳類動物的提取物可以是魚類提取物。

24、無血清培養(yǎng)基也可以與添加動物血來源的血清制品(比如0.5％到3％)一起使用，作為降低支持原代貼壁細胞或細胞系生長通常所需的總體血清濃度(5％到10％)的方法。

25、病毒的擴增可包括以下步驟：第一步，根據(jù)上述方法培養(yǎng)原代細胞，即在補充有源自植物或蔬菜來源的肽和蛋白胨的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細胞。上述在原代細胞培養(yǎng)方法中描述的所有條件和定義，也適用于根據(jù)本公開的此實施方案的病毒擴增方法的第一步的定義。第二步，用病毒感染原代細胞。第三步，將被感染的細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育，直至產(chǎn)生子代病毒。最后，在第四步將病毒從被感染的細胞中分離出來，或收集帶有病毒的細胞以保持這些被感染的細胞存活。

26、根據(jù)本發(fā)明的用于病毒擴增的方法的第二步的感染原代細胞的方法是已知的。例如，可以簡單地將病毒添加到培養(yǎng)基中。可替代地，可以將培養(yǎng)基去除，并可以將病毒添加到新鮮的培養(yǎng)基中，然后將其添加給細胞。為了獲得有效的感染，病毒/培養(yǎng)基懸液的量應盡可能低，以具有高的病毒濃度。在病毒附著之后，可以添加額外的培養(yǎng)基。

27、在本發(fā)明方法的第三步，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細胞，直到產(chǎn)生子代病毒。

28、可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法濃縮和純化子代病毒。

29、本公開所述的方法涉及一種痘病毒的擴增方法，其包括以下步驟：(ⅰ)根據(jù)上述方法，即在補充有源自植物或蔬菜來源的多肽和蛋白胨的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細胞的方法培養(yǎng)原代細胞；(ⅱ)用痘病毒感染原代細胞；(ⅲ)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細胞，直到產(chǎn)生子代病毒；和(ⅳ)從被感染的細胞中分離病毒。根據(jù)本發(fā)明的方法分離出的病毒不含有任何包含在動物血清中的制品和/或感染因子。

30、在無血清條件下對那些之前已經(jīng)在含血清條件下擴增的病毒進行傳代、培養(yǎng)和/或純化的過程稱為“再衍生”。如果不完全清楚如何獲得用于疫苗生產(chǎn)的主病毒株(masterseed)，也可以使用這種再衍生。而在無血清條件下進行的再衍生大大降低了疫苗中污染的風險，尤其是不希望的感染因子。

31、根據(jù)本公開的方法涉及培養(yǎng)原代禽類細胞和擴增病毒，其中病毒是要再衍生的病毒。例如，本發(fā)明的方法對于病毒和病毒原株(stock)的再衍生是有用的，特別是對于已經(jīng)、或者可能之前已經(jīng)在含有血清的培養(yǎng)基中進行過傳代的原株。

32、起始材料(即要再衍生的病毒)在無血清條件下的一次傳代可能對于病毒的再衍生就足夠了。術(shù)語“傳代”指的是在無血清條件下培養(yǎng)細胞、用要再衍生的病毒感染細胞以及獲取在被感染的細胞中產(chǎn)生的病毒的步驟。雖然一次傳代可能就足夠了，但可優(yōu)選在無血清條件下將病毒傳代數(shù)次。在這種情況下，用從第一次傳代步驟獲得的病毒來再次感染新鮮細胞。無血清條件下進行的傳代可與一種或多種在無血清條件下純化病毒的方法相結(jié)合。傳代的總數(shù)目可選地通過包括純化，范圍為1至大于10，比如3至8或4至6。純化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的標準病毒學方法。

33、如前所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員周知原代禽類細胞在無血清條件下生長不好。與痘病毒感染相關(guān)聯(lián)的額外壓力可能會導致已經(jīng)受到壓力的細胞在痘病毒顯著擴增發(fā)生之前死亡。令人驚訝的是，根據(jù)本發(fā)明的方法，在補充有源自植物或蔬菜來源的多肽和蛋白胨的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的禽類細胞有效支持痘病毒病毒復制和擴增。

34、痘病毒優(yōu)選是正痘病毒(orthopox?virus)。正痘病毒的例子是禽痘病毒(avipoxvirus)和牛痘病毒(vaccinia?virus)。

35、術(shù)語“禽痘病毒”指的是任何禽痘病毒，比如禽痘病毒(fowlpoxvirus)、金絲雀痘病毒、uncopoxvirus、八哥痘病毒、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、孔雀痘病毒、企鵝痘病毒、麻雀痘病毒、椋鳥痘病毒和火雞痘病毒。優(yōu)選的禽痘病毒是金絲雀痘病毒和禽痘病毒。

36、術(shù)語“馬立克氏病病毒”指的是任何一種用于生產(chǎn)馬立克氏病疫苗的甲皰疹病毒血清型，包括但不限于病毒血清型1、2和3。

37、本公開的目的之一是開發(fā)一種疫苗生產(chǎn)的方法，特別是通過上述方法獲得的痘病毒疫苗。根據(jù)優(yōu)選的實施方案痘病毒是禽痘(fp)病毒。

38、本公開的另一個目的是開發(fā)一種在無血清培養(yǎng)基中利用馬立克氏病疫苗(血清型1、2和3)生產(chǎn)來進行疫苗生產(chǎn)的方法。

39、本公開的另一個目的是開發(fā)一種包含病毒，特別是根據(jù)本公開的方法生產(chǎn)的重組馬立克氏血清型3病毒(hvt)的組合物。由于病毒擴增的方法，該組合物不含任何包含在動物血清內(nèi)的制品和/或感染因子。相反的，根據(jù)傳統(tǒng)方法生產(chǎn)出來的含病毒的組合物包含源自動物血清的殘留化合物。對于根據(jù)傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的包含馬立克氏病毒疫苗的組合物尤其如此，比如hvt病毒血清型。

40、本公開的另一個目的是開發(fā)一種在無血清培養(yǎng)基中利用傳染性法氏囊病疫苗生產(chǎn)來進行疫苗生產(chǎn)的方法。

41、本公開的另一個目的是開發(fā)一種用于治療或免疫接種有此需要的動物(包括人類)的方法，其包括對動物或人體施用上述定義的病毒或上述定義的組合物。

42、結(jié)合以下的實施例將更好地理解本公開，這些實施例旨在對本公開進行說明，而非限制本公開的范圍。

43、實施例

44、實施例1：原代雞胚成纖維細胞(cef)細胞培養(yǎng)

45、細胞培養(yǎng)準備

46、酶準備：使用gibco的tryple?select?enzyme(1x)，無需進一步稀釋。

47、生長培養(yǎng)基準備：準備培養(yǎng)基，其包含emem培養(yǎng)基和vegitone(1x)(來自sigma)，emem培養(yǎng)基中vegitone約為5％v/v。

48、胚胎的消化：在50ml來自gibco的磷酸鹽緩沖液(pbs)中將胚胎洗三遍，然后在tryple溶液中消化四次，每次消化時期持續(xù)五分鐘。

49、將細胞收集在含有50/50的vegitone和emem溶液的燒杯中，用細胞準備培養(yǎng)基(含5％vegitone?v/v的emem培養(yǎng)基)進行沖洗。然后以750rpm將細胞離心十二分鐘，并保存在2-7℃長達72小時。

50、收集總體積為110ml的細胞，細胞密度為6.0x106個細胞/ml。

51、根據(jù)下表1準備每個原代細胞培養(yǎng)容器(共6個)。

52、表1.原代細胞培養(yǎng)容器條件

53、

54、在35-39.0℃和0.2rpm下孵育48小時后，轉(zhuǎn)瓶100％匯合。

55、hvt病毒在細胞培養(yǎng)中傳代

56、以每瓶1x108個細胞的比率將原代(1°)cef細胞培養(yǎng)物接種到五個轉(zhuǎn)瓶中。以培養(yǎng)基(emem)中約5％的比率使用1x?vegitone來為cef細胞提供額外的營養(yǎng)。在39.0℃和0.2rpm下孵育48小時后，轉(zhuǎn)瓶100％匯合。

57、用1安瓿hvt?sr-3接種cef細胞，然后在35-39℃和0.2rpm下孵育，約46小時后確定細胞病變效應(cytopathic?effect，cpe)為約60％。通過胰蛋白酶消化收獲這些hvt感染的cef細胞的第一次傳代(x+1)，然后離心并重懸在含有6種不同冷凍保存培養(yǎng)基配方的小瓶中。然后使用控速冷凍機(controlled?rate?freezer)將小瓶冷凍至約-110℃。將重懸的小瓶標記為條件1的x+1(1)、條件2的x+1(2)、條件3的x+1(3)、條件4的x+1(4)、條件5的x+1(5)和條件6的x+1(6)。冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)顯示在下表2中。

58、表2：冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)

59、

60、

61、1rmbio的經(jīng)輻照的小牛血清，2sigma的1x?lb?vegitone，31％的甲基纖維素(4000cp)(來自sigma)在1％pbs-溶液中，和4將以0.5ml配制的疫苗于49.5ml?marek稀釋劑中的比率稀釋樣本，然后以1：500稀釋用于滴定和活細胞計數(shù)(1:1臺盼藍)。

62、實施例2：原代雞胚成纖維細胞(cef)細胞培養(yǎng)

63、細胞培養(yǎng)準備

64、酶準備：使用gibco的tryple?select?enzyme(1x)，無需進一步稀釋。

65、生長培養(yǎng)基準備：準備培養(yǎng)基，其包含rs-emem培養(yǎng)基和vegitone(1x)(來自sigma)，emem培養(yǎng)基中vegitone約為5％v/v。

66、胚胎的消化：在1000ml來自gibco的磷酸鹽緩沖液(pbs)中將胚胎洗3遍，然后在50ml?tryple溶液中消化四次，每次消化時期持續(xù)五分鐘。

67、將細胞收集在含有20ml的emem(含20％的vegitone)的燒杯中，用10ml細胞準備培養(yǎng)基(含5％vegitone?v/v的emem培養(yǎng)基)進行沖洗。然后以750rpm將細胞離心十二分鐘，并保存在2-7℃長達72小時。

68、收集總體積為200ml的細胞，為28x106個細胞/ml。

69、根據(jù)下表3準備每個原代細胞培養(yǎng)容器(共12個)。

70、表3.原代細胞培養(yǎng)容器條件

71、

72、hvt病毒在細胞培養(yǎng)中第二次傳代

73、以每轉(zhuǎn)瓶4.5x108個cef細胞的比率將原代(1°)cef細胞接種在十個850cm2轉(zhuǎn)瓶中并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。以培養(yǎng)基(emem)中約5％的比率使用1x?vegitone來為cef細胞提供營養(yǎng)。

74、用1ml來自表2的x+1(2)接種一個含有cef細胞懸液的轉(zhuǎn)瓶，并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。接種約50小時后，確定細胞病變效應(cpe)為約60％。使用1xtrypleselect收集這些hvt感染的細胞的第二次傳代(x+2)，并以750x?g離心15分鐘以沉淀細胞。將沉淀的細胞重懸在含有5％1x?lb?vegitone和0.1％甲基纖維素的pbs中。將2.0ml的該細胞懸液加入剩余的9個轉(zhuǎn)瓶中以產(chǎn)生hvt感染的cef細胞的第三次傳代(x+3)。

75、hvt病毒在細胞培養(yǎng)中第三次傳代

76、用2ml的第二次傳代細胞(x+2)接種九個含有cef細胞懸液的轉(zhuǎn)瓶，并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。接種約48小時后，確定細胞病變效應(cpe)為約75-80％。使用1xtrypleselect收集每個轉(zhuǎn)瓶含有第三次傳代細胞(x+3)，并以750x?g離心15分鐘以沉淀細胞。在離心前用約20ml含有10％?vegitone的emem中和tryple?select。將沉淀的細胞重懸在兩種不同的低溫保存培養(yǎng)基中，并使用控速冷凍機進行冷凍。冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)顯示在下表4中。

77、表4:冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)

78、

79、1sigma的1x?lb?vegitone，2?1％的甲基纖維素(4000cp)(來自sigma)在1％pbs-溶液中。

80、用于cef細胞培養(yǎng)的示例性培養(yǎng)基配方示于表5，用于cef細胞或感染hvt病毒的cef細胞的冷凍保存的示例性培養(yǎng)基配方示于表6。

81、表5：cef細胞培養(yǎng)基配方。示出了配制1l無血清培養(yǎng)基的量。

82、 組分 量/升 emem粉末(sigma?m1018) 10-12克 lb?broth,vegitone(sigma?28713) 0.5-2.0克 碳酸氫鈉 0.35-1.0克 抗生素溶液 0-20ml 無菌di水 加入適量補充總體積至1000ml

83、表6：cef/病毒冷凍保存培養(yǎng)基。示出了配制1l培養(yǎng)基的量。

84、 組分 量/升 emem粉末(sigma?m1018) 10-12克 碳酸氫鈉 0.35-1.0克 二甲基亞砜(dmso) 50ml 抗生素溶液 0-20ml 無菌di水 加入適量補充總體積至1000ml

85、使用根據(jù)表5的無血清培養(yǎng)基產(chǎn)生的hvt病毒產(chǎn)量與使用包含約6％小牛血清的常規(guī)生長培養(yǎng)基在相似生長/孵育條件下產(chǎn)生的批次(batch)相當(表7)。

86、表7：重組hvt病毒原株產(chǎn)量數(shù)據(jù)

87、

88、*批次效率是每個轉(zhuǎn)瓶恢復的總pfu除以接種到轉(zhuǎn)瓶中的cef細胞的總數(shù)。

89、實施例3：禽痘疫苗病毒、法氏囊病疫苗病毒和馬立克氏病疫苗病毒(血清型1、2和3)在無血清培養(yǎng)基中的生長

90、使用根據(jù)表5的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)感染/接種了根據(jù)下表8的各種原株病毒的cef細胞并置于類似生長條件，結(jié)果導致觀察到的cpe至少為50％和病毒復制(如下表8所示)。

91、表8：疫苗病毒和結(jié)果產(chǎn)量數(shù)據(jù)

92、

93、本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實施方案的限制。事實上，從前述出發(fā)，除了本文所述的那些之外，對本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。