本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肢動(dòng)脈缺血性疾病，涵蓋下肢動(dòng)脈硬化性閉塞癥(aso)、血栓閉塞性脈管炎(tao)及糖尿病肢體動(dòng)脈閉塞癥(dlao)等多種病癥，其臨床表現(xiàn)多樣，包括患肢乏力、間歇性跛行、靜息痛、肌肉萎縮，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)潰瘍、壞死乃至截肢的風(fēng)險(xiǎn)。這類疾病不僅給患者帶來極大的痛苦，治療過程漫長且復(fù)雜，還伴隨著高致殘率與死亡率，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，并造成了沉重的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，臨床治療主要依賴于動(dòng)脈旁路移植和血管腔內(nèi)技術(shù)，但這些方法受限于嚴(yán)格的適應(yīng)癥，且預(yù)后效果往往不盡人意，特別是對(duì)于年老體弱、無法耐受手術(shù)或腔內(nèi)治療效果不佳、面臨截肢風(fēng)險(xiǎn)的患者，缺乏有效的治療手段。因此，探索新的治療方法與藥物，以應(yīng)對(duì)周圍動(dòng)脈閉塞癥，成為臨床上的迫切需求。

2、近年來，大量研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(ucmscs)的旁分泌機(jī)制在改善下肢缺血方面扮演著至關(guān)重要的角色。這些干細(xì)胞通過分泌一系列生物活性分子，如上皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、成纖維因子、血細(xì)胞生長因子、黏連蛋白及血管蛋白-1等，作用于特定的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，激活并促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖與分化，進(jìn)而加速血管新生。這一過程能夠顯著增加缺血區(qū)域的血液供應(yīng)，從而提升缺血性潰瘍的愈合能力。此外，這些細(xì)胞因子還具備抑制傷口處炎癥反應(yīng)的功能，有助于加速傷口愈合進(jìn)程。然而，常規(guī)的間充質(zhì)干細(xì)胞(ucmscs)在應(yīng)用中面臨挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在其旁分泌的促血管生成因子及抗炎癥反應(yīng)因子含量較低，且對(duì)體內(nèi)微環(huán)境的適應(yīng)能力有限，這極大地限制了其治療效果。

3、另一方面，氧氣濃度作為影響細(xì)胞和微生物生長的關(guān)鍵因素，其調(diào)控對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)至關(guān)重要。例如，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在3％的低氧環(huán)境下培養(yǎng)，相較于20％的常規(guī)氧濃度，展現(xiàn)出更健康的生長狀態(tài)，dna損傷減少，應(yīng)激反應(yīng)也更為輕微。在模擬急性炎癥環(huán)境的實(shí)驗(yàn)中，tnf-α和il-1β作為缺血和損傷組織中高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子，常被用于研究。然而，常規(guī)的間充質(zhì)干細(xì)胞(如hucmscs，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等)由于旁分泌因子含量不足及對(duì)體內(nèi)微環(huán)境適應(yīng)性差，難以充分發(fā)揮其在組織缺血性損傷修復(fù)中的潛力。

4、綜上所述，針對(duì)肢動(dòng)脈缺血性疾病的治療，亟需開發(fā)能夠高效促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)，并適應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境的新型間充質(zhì)干細(xì)胞療法或相關(guān)藥物，以滿足臨床需求，改善患者預(yù)后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

3、得到p2代hucmscs細(xì)胞；

4、于氧濃度體積分?jǐn)?shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的條件下，將所述p2代hucmscs細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，得到所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs；

5、其中，所述炎性因子預(yù)激活組合物包括以下組分：10-50ng/ml?tnf-a、10-50ng/mlil-1β、0-20umol/llpa、10-100ng/ml?hgf。

6、進(jìn)一步地，得到p2代hucmscs細(xì)胞的步驟包括：從臍帶組織中分離，貼壁培養(yǎng)法獲得p2代hucmscs細(xì)胞。

7、進(jìn)一步地，得到p2代hucmscs細(xì)胞的步驟包括以下過程：

8、步驟1：氏膠，剪碎并清洗，置于培養(yǎng)皿中備用；

9、步驟2：將處理后的組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，組織塊間貼壁接種間隔距離1-2cm，于37℃、5.0％的co2條件下孵育；

10、步驟3：加入人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，接種標(biāo)記hucmscs?p0，定期觀察細(xì)胞生長情況并換液；

11、步驟4：hucmscs?p0細(xì)胞生長至融合度80％-90％，消化并收集p0代細(xì)胞，離心過濾去除組織塊，得到p0代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞hucmscs?p0；

12、步驟5：按1*10^6-2*10^6個(gè)/t75cm2瓶接種hucmscs?p1，培養(yǎng)至融合度80％-90％后再次收集，傳代培養(yǎng)和收集細(xì)胞，得到p2代hucmscs細(xì)胞。

13、進(jìn)一步地，所述步驟4包括以下過程：培養(yǎng)12-15天，hucmscs?p0細(xì)胞生長至融合度80％-90％，棄去上清培養(yǎng)液，加生理鹽水3-5ml/瓶洗滌1-2次，用0.25％胰蛋白酶/edta消化液，0.5-1ml/瓶消化下爬出細(xì)胞及組織塊，并用無血清胰蛋白酶終止液1-3ml/瓶終止消化；用50ml收集組織塊及細(xì)胞懸液，1000-2000rpm離心5min,棄上清液，加入適量生理鹽水混勻，用70-100μm濾網(wǎng)過濾去除組織塊，即得到p0代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞hucmscs?p0。

14、進(jìn)一步地，所述步驟5包括以下過程：按1*10^6-2*10^6個(gè)/t75cm2瓶接種hucmscsp1，每瓶加入10-20ml人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，置于37℃?5.0％?co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)每2-4天待細(xì)胞融合率達(dá)到80％-90％時(shí)，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p1代細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)按1:3傳代hucmscs?p2，待細(xì)胞融合率達(dá)到80％-90％時(shí)，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p2代細(xì)胞。

15、進(jìn)一步地，于氧濃度體積分?jǐn)?shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的條件下，將所述p2代hucmscs細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，得到所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs的步驟包括以下過程：

16、hucmscs-p2代細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，采用氧體積分?jǐn)?shù)濃度范圍額1％-10％的三氣培養(yǎng)箱、20-30ml/t175cm2人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、炎性因子預(yù)激活組合物、按細(xì)胞計(jì)數(shù)按1:3傳代hucmscs-p3，培養(yǎng)2-4天，待細(xì)胞融合率達(dá)到80％-90％時(shí)，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p3代細(xì)胞及其細(xì)胞上清液。

17、第二方面，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs，所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs是采用第一方面任一項(xiàng)所述的制備方法制得。

18、進(jìn)一步地，所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs分泌vegf蛋白水平為483.76±92.34pg/ml。

19、第三方面，本發(fā)明提供了一種第一方面和第二方面任一項(xiàng)所述的高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs在制備治療肢動(dòng)脈缺血性疾病藥物中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明實(shí)施例提供的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比至少具有如下優(yōu)點(diǎn)：

21、本發(fā)明實(shí)施例提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明通過于氧濃度體積分?jǐn)?shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的特定條件下，將所述p2代hucmscs細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，使ucmscs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)階段適應(yīng)體內(nèi)缺氧的病理微環(huán)境，誘導(dǎo)ucmscs對(duì)損傷微環(huán)境的記憶,保護(hù)ucmscs對(duì)抗不利的微環(huán)境，維持基因的穩(wěn)定性。維持ucmscs的未分化狀態(tài),促進(jìn)了ucmscs的增殖和存活,同時(shí)促進(jìn)其旁分泌功能增強(qiáng)，如促血管生成因子vegf、hgf和堿性成纖維細(xì)胞生長因子bfgf、egf等的分泌增加，使其表現(xiàn)出更好的特性并具有更好的下肢缺血性損傷的修復(fù)效果，解決了現(xiàn)有hucmscs存在旁分泌的促血管生成和抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子含量比較低，適應(yīng)體內(nèi)微環(huán)境能力差等問題，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足。