本發(fā)明屬于病毒檢測，尤其涉及一種用于檢測鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr引物探針組、檢測體系及試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鴨病毒性腸炎是由鴨腸炎病毒(duck?enteritis?virus，dev)引起的一種急性傳染病也稱鴨瘟，影響鴨、鵝、天鵝等多種水禽物種，并通過遷徙水禽在各大洲之間廣泛傳播。其特征為侵害血管、消化道黏膜糜爛、組織出血、淋巴器官病變及其實(shí)質(zhì)器官的退行性病變?？祻?fù)后的鴨仍可能帶毒和排毒，導(dǎo)致該病在鴨群中廣泛地傳播，嚴(yán)重的影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(goose?parvovirus，gpv)引起的急性敗血性傳染病，該病的病變特征為小腸黏膜表層大片壞死、脫落與纖維性滲出物凝成栓塞物或假膜包裹在腸內(nèi)容物表面，堵塞腸腔形成“腸栓塞”。主要侵害雛鵝與雛番鴨，該病一年四季均可發(fā)生，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，是危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成重大損失。隨著鵝細(xì)小病毒重組或不斷變異，感染譜也不斷擴(kuò)大。與小鵝瘟同為細(xì)小病毒科的番鴨細(xì)小病毒(muscovy?duckparvovirus，mdpv)也同樣影響著水禽產(chǎn)業(yè)，其臨床癥狀為呼吸困難、胰腺壞死、滲出性腸炎導(dǎo)致的腹瀉等，感染番鴨的死亡率可達(dá)10％～80％。由于兩者不僅在病毒大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)蛋白、理化特性和核酸類型等方面極為相似，而且流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化也極為相似，所以小鵝瘟在臨床上與番鴨細(xì)小病毒病容易混淆。

2、病毒檢測方法的建立對于水禽傳染病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。常見的病毒檢測方法包括分子生物學(xué)檢測、病原分離鑒定和血清學(xué)檢測等。分子生物學(xué)檢測技術(shù)如pcr(聚合酶鏈反應(yīng))能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出病毒的核酸，對于早期發(fā)現(xiàn)病毒感染具有重要意義。血清學(xué)檢測則通過檢測血清中的抗體水平來判斷禽類是否曾經(jīng)感染過某種病毒，是一種常用的流行病學(xué)調(diào)查方法。但上述兩種方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差等缺點(diǎn)，特別是當(dāng)水禽混合感染多種病原時(shí)，應(yīng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行早期快速檢測和鑒別診斷。然而，基于taqman探針同時(shí)檢測dev、mdpv和gpv尚未見報(bào)道。因此，為了可以即時(shí)發(fā)現(xiàn)疫病出現(xiàn)以及采取有效防控措施，開發(fā)一種便利，快速和有效的同時(shí)檢測dev、mdpv和gpv的方法是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr引物探針組，所述引物探針組可同時(shí)檢測3種水禽傳染病病原，3種病原間無交叉反應(yīng)，且穩(wěn)定性高。

2、本發(fā)明的目的還在于提供一種鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr檢測體系。

3、本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr試劑盒。

4、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明提供了一種用于檢測鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr引物探針組，所述引物探針組包括檢測鴨腸炎病毒的上游引物dev-f、下游引物dev-r和熒光探針dev-probe；檢測鵝細(xì)小病毒的上游引物gpv-f、下游引物gpv-r和熒光探針gpv-probe以及檢測番鴨細(xì)小病毒的上游引物mdpv-f、下游引物mdpv-r和熒光探針mdpv-probe；

6、所述檢測鴨腸炎病毒的上游引物dev-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，下游引物dev-r的核苷酸序列如seq?id?no.2，熒光探針dev-probe的核苷酸序列如seq?id?no.3；

7、所述檢測鵝細(xì)小病毒的上游引物gpv-f的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，下游引物gpv-r的核苷酸序列如seq?id?no.6，熒光探針gpv-probe的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

8、所述檢測番鴨細(xì)小病毒的上游引物mdpv-f的核苷酸序列如seq?id?no.10所示，下游引物mdpv-r的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，熒光探針mdpv-probe的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

9、優(yōu)選地，所述引物探針組中熒光探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)。

10、更優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)包括hex、cy5或fam中的一種；所述熒光猝滅基團(tuán)包括bhq1或bhq2。

11、本發(fā)明還提供了一種用于檢測鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr試劑盒，所述試劑盒包含所述的多重qpcr引物探針組。

12、本發(fā)明還提供了一種鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr的檢測體系，所述多重qpcr的檢測體系包含所述的多重qpcr引物探針組。

13、優(yōu)選地，所述多重qpcr的檢測體系以25μl總體積計(jì)，包括如下組分：12.5μlprobeqpcr?mix，混合模板2μl，8～12μm的上游引物dev-f?0.6μl，8～12μm的下游引物dev-r?0.6μl，8～12μm的熒光探針dev-probe?0.8μl；8～12μm的上游引物gpv-f?0.8，8～12μm的下游引物gpv-r?0.8μl，8～12μm的熒光探針gpv-probe?1μl；8～12m的上游引物mdpv-f?0.6μl，8～12μm的下游引物mdpv-r?0.6μl，8～12μm的熒光探針mdpv-probe?0.8μl；3.9μl?ddh2o。

14、更優(yōu)選地，所述混合模板中鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒三種病原模板按等體積比混合。

15、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的鴨腸炎病毒、鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的多重qpcr檢測方法，包括如下步驟：

16、提取待檢樣品的rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna；

17、以上述cdna為模板，利用所述的多重qpcr引物探針組，或所述的試劑盒，或所述的檢測體系進(jìn)行多重qpcr擴(kuò)增；

18、反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線情況判斷待檢樣品中dev、gpv和mdpv是否為陽性。

19、優(yōu)選地，所述判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：若待測樣品檢測出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且ct≤35，則判定為陽性；若熒光通道35<ct≤38則判定為可疑，需要重新檢測；若熒光通道沒有擴(kuò)增曲線或ct值>38則判定為陰性。

20、優(yōu)選地，所述多重qpcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃、30s；變性95℃、5s，退火48℃、30s，延伸72℃、20s，40個(gè)循環(huán)。

21、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

22、本發(fā)明提供了一種檢測鴨腸炎病毒dev、鵝細(xì)小病毒gpv和番鴨細(xì)小病毒mdpv?3種水禽傳染病病原的引物探針組，所述引物探針組對3種水禽傳染病病原進(jìn)行檢測，具有良好的特異性與靈敏度，相較于目前應(yīng)用較多的pcr檢測、病原分離鑒定和血清學(xué)檢測，具有相當(dāng)?shù)臋z測靈敏度。本發(fā)明所述引物探針組可同時(shí)檢測3種水禽傳染病病原，3種病原間無交叉反應(yīng)，且穩(wěn)定性高，其變異系數(shù)都在10％以下。本發(fā)明還建立了同時(shí)檢測dev、gpv和mdpv的多重qrt-pcr體系和方法，利用本發(fā)明提供的多重qrt-pcr檢測體系和方法可以快速檢測出dev、gpv和mdpv這三種病毒，可以為這三種病毒提供有效的預(yù)防，有望減少水禽養(yǎng)殖上的經(jīng)濟(jì)損失。