本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速鑒別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的引物探針組合、dna甲基化檢測(cè)方法及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、急性髓細(xì)胞性白血病(acute?myeloid?leukemia,aml)是一類高度惡性、異質(zhì)性的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其主要病因是造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic?stem?andprogenitor?cell,hspc)在各種因素刺激下發(fā)生突變，失去進(jìn)一步分化、成熟的能力，使得造血阻止在不同的階段。同時(shí)，惡變的造血干細(xì)胞獲得無限克隆增殖的能力，并大量增殖，消耗各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并抑制正常造血細(xì)胞生成，最終導(dǎo)致各種白血病的發(fā)生。臨床以感染、出血、貧血和髓外組織器官浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)，病情進(jìn)展迅速，自然病程僅有數(shù)周至數(shù)月。

2、由于不同譜系造血干細(xì)胞都具有惡變?yōu)榘籽〖?xì)胞的能力，導(dǎo)致白血病細(xì)胞形態(tài)變化多樣，異質(zhì)性高，難以用形態(tài)學(xué)方法，如瑞氏染色來區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞。同時(shí)不同譜系的白血病細(xì)胞表達(dá)不同的白血病分化抗原，導(dǎo)致流式細(xì)胞儀難以準(zhǔn)確區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞(canali?a,vergnolle?i,bertoli?s,et?al.prognostic?impactof?unsupervised?early?assessment?of?bulk?and?leukemic?stem?cell?measurableresidual?disease?in?acute?myeloid?leukemia.clin?cancer?res.2023；29(1):134-142.)。為了快速有效地鑒別和區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞，特發(fā)明本甲基化檢測(cè)方法。

3、dna甲基化修飾是表觀遺傳修飾中一種重要的修飾方式。dna甲基化是指在dna甲基化轉(zhuǎn)移酶(dna?methyltransferases,dnmts)作用下，將s-腺苷甲硫氨酸上的甲基(ch3)轉(zhuǎn)移到dna雙鏈cpg二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上，形成5'-甲基胞嘧啶。絕大多數(shù)dna甲基化修飾發(fā)生在cpg島，而在人類基因組中有60-90％的cpg島發(fā)生甲基化。因?yàn)閏pg島通常位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，故對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著重要作用。dna異常甲基化作為白血病強(qiáng)有力的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，在白血病的預(yù)后判斷和治療決策等方面具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力(lizg,jiao?y,li?wj,et?al.hypermethylation?of?two?cpg?sites?upstream?of?casp8ap2promoter?influences?gene?expression?and?treatment?outcome?in?childhood?acutelymphoblastic?leukemia.leuk?res.2013；37(10):1287-1293.)。dna異常甲基化，包括dna總體低甲基化以及特定腫瘤抑制基因啟動(dòng)子位點(diǎn)的高甲基化，是白血病細(xì)胞區(qū)別于正常造血細(xì)胞的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

4、已有區(qū)別白血病細(xì)胞和造血細(xì)胞的方法如下：

5、1.瑞氏吉姆薩染色：通過將白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色，形態(tài)學(xué)上區(qū)別惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞。

6、2.流式細(xì)胞儀分析：通過檢測(cè)白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞細(xì)胞膜表面分化抗原區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞。

7、3.過氧化物酶(pox)染色：通過將白血病細(xì)胞和造血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，通過檢測(cè)染色的強(qiáng)弱，區(qū)別惡性白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞。

8、目前并沒有成熟的方法區(qū)別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞。將白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色，通過形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒別診斷。由于白血病細(xì)胞和造血細(xì)胞都呈現(xiàn)細(xì)胞核偏大、細(xì)胞漿偏少等原始細(xì)胞形態(tài)，容易混淆診斷。該方法主要缺點(diǎn)是主觀性強(qiáng)，合格的骨髓形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技師需要長(zhǎng)時(shí)間的培訓(xùn)。

9、過氧化物酶(pox)染色是一種細(xì)胞化學(xué)染色，主要用于急性白血病的分類。pox染色強(qiáng)陽性時(shí)提示急性髓細(xì)胞白血病，然而急性單核細(xì)胞白血病也可呈現(xiàn)陰性或者弱陽性，而正常造血干細(xì)胞的pox染色也可呈現(xiàn)陰性或者弱陽性。因此，過氧化物酶染色并不能很好地區(qū)分白血病干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。

10、目前研究表明，沒有統(tǒng)一的白細(xì)胞表面分化抗原可以準(zhǔn)確快速的區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞，因此傳統(tǒng)的流式細(xì)胞檢測(cè)方法并不容易區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞。

11、已有一些研究報(bào)道在白血病和正常造血細(xì)胞中存在差異表達(dá)的dna甲基化修飾。例如，spred1(sun?j,zhang?j,wang?y,et?al.a?pilot?study?of?aberrant?cpg?islandhypermethylation?of?spred1?in?acute?myeloloid?leukemia.int?j?med?sci.2019；16(2):324-330.)、rassf6(younesian?s,shahkarami?s,ghaffari?p,et?al.dnahypermethylation?of?tumor?suppressor?genes?rassf6?and?rassf10?as?independentprognostic?factors?in?adult?acute?lymphoblastic?leukemia.leuk?res.2017；61:33-38.)、dlx4(zhou?jd,zhang?tj,wang?yx,et?al.dlx4?hypermethylation?is?aprognostically?adverse?indicator?in?de?novo?acute?myeloid?leukemia.tumourbiol.2016；37(7):8951-8960.)等基因啟動(dòng)子在aml細(xì)胞中的dna甲基化修飾水平明顯高于正常造血細(xì)胞。然而，以上論文并沒有通過甲基化特異性pcr方法在白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞中檢測(cè)dna甲基化水平，并不能很好的利用差異化的dna甲基化水平區(qū)分白血病細(xì)胞和造血細(xì)胞。因此，為了有效地區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞，本專利預(yù)先利用生物信息學(xué)分析現(xiàn)有的dna甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在7號(hào)染色體微小rna(mir-182)啟動(dòng)子區(qū)域存在4個(gè)cpg島，大數(shù)據(jù)初步分析mir-182啟動(dòng)子cpg島可能存在較高的甲基化修飾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不容易區(qū)分白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的問題，提出一種快速鑒別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的引物探針組合、dna甲基化檢測(cè)方法及其試劑盒。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

3、作為第一方面，本發(fā)明提供一種快速鑒別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的引物探針組合，包括內(nèi)參基因β-actin的甲基化特異性引物探針組合和mir-182啟動(dòng)子的甲基化特異性引物探針組合；

4、所述內(nèi)參基因β-actin的甲基化特異性引物探針組合包括：前向引物β-actin-f，其序列如seq?id?no.1所示，反向引物β-actin-r，其序列如seq?id?no.2所示，探針β-actin-probe，其序列如seq?id?no.3所示；

5、所述mir-182啟動(dòng)子的甲基化特異性引物探針組合包括：前向引物182-msp-f，其序列如seq?id?no.4所示，反向引物182-msp-r，其序列如seq?id?no.5所示，探針182-msp-probe，其序列如seq?id?no.6所示；

6、其中，所述序列為5’-3’。

7、進(jìn)一步地，探針β-actin-probe和探針182-msp-probe的5’端均連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)。

8、作為第二方面，本發(fā)明提供一種快速鑒別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的甲基化檢測(cè)方法，包括以下步驟：

9、提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞dna；

10、通過亞硫酸氫鹽法對(duì)dna進(jìn)行轉(zhuǎn)化并純化；

11、采用所述mir-182啟動(dòng)子的甲基化特異性引物探針組合和內(nèi)參基因β-actin的甲基化特異性引物探針組合對(duì)亞硫酸氫鹽法處理后的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過甲基化特異性熒光定量pcr法分別檢測(cè)mir-182啟動(dòng)子和內(nèi)參基因β-actin的甲基化水平，得到mir-182啟動(dòng)子ct值和內(nèi)參基因β-actin?ct值；

12、計(jì)算δct＝mir-182啟動(dòng)子ct值-內(nèi)參基因β-actin?ct值，作為區(qū)別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

13、進(jìn)一步地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10.0μl?2×biosmart?methylight?qpcrmix，0.4μl、10μg/μl前向引物，0.4μl、10μg/μl反向引物，0.2μl、10μg/μl探針，2μl、0.5μg/μl亞硫酸氫鹽法處理后的dna，補(bǔ)加超純水h2o至20.0μl；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火30s，共50個(gè)循環(huán)。

14、進(jìn)一步地，計(jì)算得到δct+10，δct+10＜15.82為陽性，δct+10≥15.82為陰性。

15、作為第三方面，本發(fā)明還提供一種快速鑒別白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞的試劑盒，包括所述引物探針組合。

16、優(yōu)選的，所述試劑盒還包括biosmart?methylight?qpcr?mix試劑、陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。

17、本發(fā)明具有以下的有益效果：

18、(1)dna樣本容易獲取，且dna化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，樣本的保存和處理過程對(duì)條件的要求不高，更容易在臨床開展檢測(cè)。dna甲基化是一種穩(wěn)定的生物學(xué)指標(biāo)，不會(huì)在短期內(nèi)因?yàn)榛颊叩乃幬镏委熂捌渌眢w狀態(tài)改變而發(fā)生改變，dna甲基化的這一特點(diǎn)使該方法結(jié)果更穩(wěn)定和可信。

19、(2)dna甲基化改變往往發(fā)生在腫瘤的早期，能夠做到腫瘤的早篩和早診。

20、(3)本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)便易行，特異性高，能夠批量檢測(cè)，結(jié)果判讀客觀準(zhǔn)確，容易做成甲基化檢測(cè)試劑盒，具備較好的應(yīng)用前景。