本發(fā)明涉及原代細(xì)胞(pdc)培養(yǎng)相關(guān)，尤其涉及一種膠質(zhì)瘤病人來源的原代細(xì)胞(pdc)培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、目前已有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系難以真實(shí)反映病人的腫瘤特征，主要體現(xiàn)在無法保留腫瘤的轉(zhuǎn)錄特征、基因突變和瘤內(nèi)異質(zhì)性等，永生化的細(xì)胞系限制了研究者對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行深入理解和制定有效的治療策略，因此，構(gòu)建能夠更好的代表膠質(zhì)瘤病人腫瘤特征的原代細(xì)胞模型，基于原代細(xì)胞發(fā)展原位動物模型尤為重要，原代細(xì)胞和動物模型理論上能夠更準(zhǔn)確地模擬病人的腫瘤，包括腫瘤的異質(zhì)性和微環(huán)境，可為研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物靶標(biāo)及開發(fā)新療法提供強(qiáng)有力的工具；

2、目前已有的膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要集中在對腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)，包括單層培養(yǎng)和腫瘤球體培養(yǎng)；但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要大量時(shí)間來建立，使用的外源性的egf，bfgf選擇性的擴(kuò)增了腫瘤干細(xì)胞，無法保留其他腫瘤細(xì)胞亞群，病人來源的腫瘤組織異種移植模型(pdx)能更好地模擬腫瘤組織的瘤內(nèi)異質(zhì)性，然而其移植效率低下，腫瘤生長時(shí)間從2到11個(gè)月不等，不適合臨床個(gè)性化治療測試，近幾年，膠質(zhì)瘤的類器官模型(pdo)逐步發(fā)展，pdo模型可以很好地展現(xiàn)出腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，然而此類器官培養(yǎng)用到的基質(zhì)膠等材料價(jià)格高昂，細(xì)胞傳代過程比較復(fù)雜，在高通量藥物篩選時(shí)無法快速均勻地將pdo種植在384或1536孔板內(nèi)，不適合大規(guī)模的藥物試驗(yàn)，因此，開發(fā)有效的、適用于高通量藥物篩選的膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞模型至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種膠質(zhì)瘤病人來源的原代細(xì)胞(pdc)培養(yǎng)方法，為克服技術(shù)背景中細(xì)胞傳代的過程比較復(fù)雜，在高通量藥物篩選時(shí)無法快速均勻地將pdo種植在384或1536孔板內(nèi)，不適合大規(guī)模的藥物試驗(yàn)的問題，本發(fā)明提出一種膠質(zhì)瘤病人來源的原代細(xì)胞(pdc)培養(yǎng)方法，以緩解前述問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種膠質(zhì)瘤病人來源的原代細(xì)胞(pdc)培養(yǎng)方法，具體步驟如下：

3、s1、swiss3t3-j2細(xì)胞培養(yǎng)：

4、s11、swiss3t3-j2小鼠成纖維細(xì)胞dmem完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合率達(dá)60％-70％后進(jìn)行細(xì)胞傳代；

5、s12、j2細(xì)胞傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)基，用pbs洗一遍貼壁細(xì)胞，用胰蛋白酶/edta溶液消化；

6、s13、顯微鏡下觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞呈圓形并開始從培養(yǎng)基皿底部脫落時(shí)，輕輕敲打培養(yǎng)瓶促進(jìn)細(xì)胞脫落；

7、s14、通過向細(xì)胞中加入四倍體積的dmem完全培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶/edta的作用；

8、s15、在4℃下以300g離心5分鐘，將細(xì)胞重懸于10ml?dmem完全培養(yǎng)基中，每平方厘米接種3×103個(gè)細(xì)胞，約三天傳代；

9、s2、條件培養(yǎng)基制備：

10、s21、將swiss3t3-j2細(xì)胞懸浮在dmem完全培養(yǎng)基中，使用6mv電子射線、x射線和鈷-60放射源分別以10gy，30gy和60gy輻射劑量進(jìn)行細(xì)胞輻照；

11、s22、輻照后，將1.0×107至1.5×107的細(xì)胞接種于175cm2的組織培養(yǎng)瓶中，加入30ml?f培養(yǎng)基；

12、s23、72小時(shí)后收集3t3細(xì)胞生產(chǎn)的培養(yǎng)基，在4℃下以1000g離心5分鐘；

13、s24、使用濾器過濾培養(yǎng)基，將處理后的培養(yǎng)基凍存于-80℃，使用前，將三份量的3t3細(xì)胞生產(chǎn)的培養(yǎng)基與一份量的新鮮f培養(yǎng)基混合，加入y-27632(10μm)配成條件培養(yǎng)基cm；

14、s3、腦腫瘤組織預(yù)處理：

15、s31、手術(shù)后1小時(shí)內(nèi)，使用4℃預(yù)冷的pbs快速沖洗切除的組織樣本，將組織轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)皿中，用鑷子和解剖刀去除殘留的脂肪組織，切成約1cm3的小塊，盡可能徹底地從周圍正常組織中切出病變的腫瘤，每個(gè)樣本至少使用一個(gè)切片進(jìn)行病理學(xué)檢查；

16、s32、將樣本投入f培養(yǎng)基(含10μmy-27632)中，4℃運(yùn)輸；

17、s4、原代腫瘤細(xì)胞消化和培養(yǎng)：

18、s41、將10×的膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液用f培養(yǎng)基稀釋至1×，將3ml?f培養(yǎng)基/膠原酶/透明質(zhì)酸酶與1ml的dispase混合；

19、s42、使用乙醇快速沖洗切除的組織樣本，然后用冰預(yù)冷的pbs沖洗；

20、s43、取1cm3的組織塊，用解剖刀將組織切碎；

21、s44、將組織碎片轉(zhuǎn)移到含有4ml?f培養(yǎng)基/膠原酶/透明質(zhì)酸酶/dispase的試管中，在搖床上孵育消化；

22、s45、組織充分酶解分離后，4℃以500g離心5分鐘，棄去上清，將細(xì)胞重懸于10ml?f培養(yǎng)基中；

23、s46、通過100μm細(xì)胞篩將細(xì)胞懸浮液過濾到新的50ml離心管中；

24、s47、將細(xì)胞懸液按培養(yǎng)基種類均分后加入到離心管中，4℃以300g離心5分鐘，棄去上清收集細(xì)胞沉淀，用cm條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后將細(xì)胞種在t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

25、優(yōu)選的，所述s11中j2細(xì)胞容易出現(xiàn)生長抑制，傳代時(shí)生長密度不能超過4×104/cm2。

26、優(yōu)選的，所述s12中pbs洗一遍貼壁細(xì)胞的條件為室溫下用0.05％的胰蛋白酶/edta溶液消化1分鐘。

27、優(yōu)選的，所述s22中f培養(yǎng)基配方(括號中為體積或終濃度)：dmem完全培養(yǎng)基(373ml)，f12?nutrient?mix(125ml)，hydrocortisone(25ng/ml)，egf(0.125ng/ml)，insulin(5μg/ml)，cholera?toxin(0.1nm)，amphotericin?b(250ng/ml)，gentamicin(10mg/ml)。

28、優(yōu)選的，所述s24中濾器為0.22μm孔徑的millex-gp濾器。

29、優(yōu)選的，所述s42中乙醇的濃度為95％—100％，且沖洗時(shí)間最多為3秒。

30、優(yōu)選的，所述s44中搖床上孵育消化溫度為37℃，且時(shí)間為1-3小時(shí)。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

32、使用高能電子(e)，x射線(x)和鈷-60放射源(60co)輻照后的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)原代人源腫瘤細(xì)胞，通過篩選和優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以最有效地保留親本腫瘤關(guān)鍵特征的培養(yǎng)條件和建模流程，并在細(xì)胞分子水平、細(xì)胞表型和動物顱內(nèi)腫瘤模型等層面考察pdc是否保留親本腫瘤的關(guān)鍵特征。

33、將條件重編程技術(shù)應(yīng)用于膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)，構(gòu)建的pdc與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系相比，在模擬病人腫瘤的異質(zhì)性方面表現(xiàn)優(yōu)異，體外培養(yǎng)的pdc顯示出腦部神經(jīng)細(xì)胞的分子特征，表達(dá)nestin，cd44，o4和gfap等膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物，pdc的rna測序顯示其在轉(zhuǎn)錄水平上與親本腫瘤有極高的相似性，全外顯子測序顯示pdc保留了腫瘤細(xì)胞dna變異特征，在膠質(zhì)瘤典型突變idh1r132h上與親本腫瘤保持一致，pdc能被高效植入成年小鼠大腦中形成腫瘤，動物模型同樣出現(xiàn)了典型的膠質(zhì)瘤組織學(xué)特征，腫瘤組織惡性程度高，出現(xiàn)腦皮層侵襲浸潤，遠(yuǎn)端遷移和神經(jīng)元包圍等gbm腫瘤特征，基于pdc分子表型和生物學(xué)表型的表征均顯示，構(gòu)建的pdc可以很好地模擬腫瘤的在體狀態(tài)。

34、相較于傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方法，使用的條件重編程方法極大保留了腫瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性，對pdc的單細(xì)胞測序顯示，腫瘤細(xì)胞包含mes樣、星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞樣、opc樣細(xì)胞和干細(xì)胞等腫瘤中存在的多種細(xì)胞類群，基于單細(xì)胞cnv的分析顯示pdc保留了腫瘤染色體異常特征，如gbm常見的7號、8號染色體擴(kuò)增和6號、10號、13號、14號染色丟失，而干細(xì)胞培養(yǎng)方法不能保留腫瘤細(xì)胞染色體的變異，7號染色擴(kuò)增是膠質(zhì)瘤常見的染色體變異，其中有編碼egfr的區(qū)域，膠質(zhì)瘤中egfr的高表達(dá)和這一染色體改變有關(guān)聯(lián)，而8號染色體擴(kuò)增可以導(dǎo)致許多oncogene的過表達(dá)，比如myc等，10號染色體區(qū)域的丟失常常涉及pten的缺失，pten作為重要的抑癌基因，其缺失與腫瘤的高度侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，染色體變異是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，構(gòu)建的pdc在染色體變異上保留了病人的特征。