本發(fā)明涉及生物，具體涉及閩楠pbgrf1基因及其在促進植物葉片生長中的應用。

背景技術：

1、閩楠(phoebe?bournei)，樟科(lauraceae)楠屬(phoebe)常綠大喬木，主要分布于中國亞熱帶地區(qū)，是我國特有珍稀樹種。閩楠喜溫暖濕潤氣候，大部分以散生形式生長在溝谷或背陰的坡面。閩楠木材芳香怡人，干形通直，紋理美觀，耐腐防潮性能好，常被用于建筑、高檔家具、造船、雕刻等用途，深受廣大群眾喜歡，享有“金絲楠木”之美譽。閩楠作為常綠大喬木，樹干修直，冠形優(yōu)美，被用作現(xiàn)代園林綠化。近幾年，有研究表明閩楠葉片和木材中提取的精油，能夠抑制真菌活性，在抗腫瘤方面也具有一定作用。因此，閩楠具有重要經(jīng)濟與生態(tài)價值，是中國特有珍稀用材與觀賞樹種。但目前閩楠天然林生長緩慢，野生資源過度采伐，使閩楠種質資源數(shù)量急劇減少，天然純林面積變小，群體之間相隔距離較大，生境片段化，被列為國家保護植物。

2、生長調控因子(growth-regulating-factor,grf)基因是植物中一類高度保守的轉錄因子家族，對植物的生長發(fā)育、信號傳導、脅迫應答和再生效率等方面具有重要的調控作用。多數(shù)grf為mir396的靶基因，受其負調控。grf常和另外一類蛋白質因子gif(grf-interacting-factor)相互作用來共調節(jié)靶基因的表達，從而調控植物的生長發(fā)育。grf家族通常含有兩個保守域，wrc(trp,arg,cys)和qlq(gln,leu,gln)，是劃分grf家族的重要依據(jù)。近年來的眾多研究表明，grf參與到植物發(fā)育的多方面，其信號通路介導植物葉片發(fā)育、根系生長、花的發(fā)育等重要的生命過程，體現(xiàn)出強大的調控功能。在提高植物的再生方面也取得了實質性的進展，grf的表達不僅能解決了傳統(tǒng)轉化方案中轉基因株系再生效率低、費時費力的不足，還沒有其他發(fā)育調節(jié)因子(例如bbm,wus)損害植物生殖器官發(fā)育的缺陷，為提高再生效率提供了新的方法。

3、轉錄因子(transcription?factors,tfs)是真核生物中一類能夠與dna特異性結合并調節(jié)該區(qū)域基因表達的一大類蛋白質，對靶基因的調控涉及到動植物發(fā)育的所有層面，其群體構成非常復雜，有的以單個成員形式存在，有的以家族成員的形式出現(xiàn)。其中，grf家族是植物中特有的一類轉錄因子。在對grf的研究過程中，最初僅確定在葉和莖的發(fā)育中具有調節(jié)作用，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)grf在葉片生長、開花、種子和根的發(fā)育、植物壽命、逆境下生長調控等生命過程的調節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。

4、大部分grf對葉片生長具有促進作用。研究表明，擬南芥中atgrf1基因、atgrf2基因、atgrf3基因和atgrf5基因過表達都將導致葉面積增大，表明這四個基因能夠調節(jié)葉片的發(fā)育，其中atgrf1基因、atgrf2基因、atgrf3基因和atgrf5基因過表達系顯示出更大的葉面積是由于細胞體積的增大而非細胞數(shù)量的增加所導致。這三個基因單基因功能缺失突變體并沒有表現(xiàn)出異常的表型，而atgrf1/2/3三突變體與atgrf1/2/3/4四重突變體相似，均會導致葉面積較小，且葉柄更短。與atgrf1基因、atgrf2基因、atgrf3基因和atgrf5基因不同的是atgrf5基因過表達系顯示出更大的葉面積是由于細胞數(shù)量增加所致，其單基因突變株也會由于細胞數(shù)量減少而發(fā)育出比野生型更窄的葉。并非所有的擬南芥grfs都對葉片生長起到正向調節(jié)作用，atgrf9基因能夠通過直接激活org3(obp3-responsive?gene3)基因的表達從而降低細胞周期活性，導致葉片面積減小。反之亦然，其功能缺失將增強細胞周期活性，進而導致葉片面積增大，這表明atgrf9基因通過抑制葉原基細胞增殖來調控葉片生長。然而，尚未有研究報道閩楠pbgrf1基因的功能。

5、申請人基于轉錄組數(shù)據(jù)以及qrt-pcr數(shù)據(jù)，篩選克隆獲得閩楠pbgrf1基因，通過異源轉擬南芥驗證其生物功能，揭示閩楠pbgrf1基因在閩楠葉片調控中的分子機制，有助于通過分子生物學手段調控閩楠的葉片生長，為其育種和保護提供新的策略。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了涉及閩楠pbgrf1基因及其在促進植物葉片生長中的應用。

2、本發(fā)明提供了一種閩楠pbgrf1基因，該閩楠pbgrf1基因具有seq?id?no:1所示的核苷酸序列，或者對該序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。優(yōu)選情況下，閩楠pbgrf1基因的核苷酸序列為seq?id?no：1。

3、本發(fā)明還提供了閩楠pbgrf1基因編碼的蛋白，該蛋白由seq?id?no.2所示的氨基酸組成。

4、本發(fā)明還提供了一種促進植物葉片生長的方法，該方法包括制備含有閩楠pbgrf1基因的修飾植物，相對于野生型植物，在該修飾植物中，閩楠pbgrf1基因的表達增加；其中，閩楠pbgrf1基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。需要說明的是，“表達增加”的概念中，“表達”是指是基因經(jīng)過轉錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質的過程；上述過程的強度增加即為表達增加，具體地，可以為轉錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物增加。

5、本發(fā)明還提供了閩楠pbgrf1基因在促進植物葉片生長中的應用，制備含有閩楠pbgrf1基因的修飾植物，相對于野生型植物，在該修飾植物中，閩楠pbgrf1基因的表達增加；其中，閩楠pbgrf1基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。需要說明的是，“表達增加”的概念中，“表達”是指是基因經(jīng)過轉錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質的過程；上述過程的強度增加即為表達增加，具體地，可以為轉錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物增加。

6、在一個實施方案中，上述植物為閩楠或擬南芥。

7、在一個實施方案中，上述植物為擬南芥。

8、在一個實施方案中，將閩楠pbgrf1基因基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉基因株系。轉基因擬南芥與野生型相比，過表達pbgrf1基因能促進擬南芥葉片增大，且提高了幼苗的生物量比如干重以及鮮重。

9、本申請克隆閩楠pbgrf1基因并通過根癌農桿菌介導花序侵染法轉化擬南芥，獲得閩楠pbgrf1基因過表達植株，通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，過表達閩楠pbgrf1基因的擬南芥比野生型col葉片面積更大，同時，過表達植株的鮮重和干重也比野生型更重。

技術特征：

1.一種閩楠pbgrf1基因，其特征在于，所述閩楠pbgrf1基因具有seq?id?no:1所示的核苷酸序列，或者對所述序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。

2.根據(jù)權利要求1所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為seq?id?no：1。

3.權利要求1或2所述基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白由seq?id?no.2所示的氨基酸組成。

4.一種促進植物葉片生長的方法，該方法包括制備含有閩楠pbgrf1基因的修飾植物，其特征在于，相對于野生型植物，在所述修飾植物中，所述閩楠pbgrf1基因的表達增加；其中，所述閩楠pbgrf1基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。

5.閩楠pbgrf1基因在促進植物葉片生長中的應用，其特征在于，制備含有閩楠pbgrf1基因的修飾植物，相對于野生型植物，在所述修飾植物中，所述閩楠pbgrf1基因的表達增加；其中，所述閩楠pbgrf1基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。

6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述植物為閩楠或擬南芥。

7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述植物為擬南芥。

8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，將所述閩楠pbgrf1基因基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉基因株系。

技術總結
本發(fā)明公開了一種閩楠PbGRF1基因，該閩楠PbGRF1基因具有SEQ?ID?No:1所示的核苷酸序列，或者對該序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。本發(fā)明還公開了閩楠PbGRF1基因編碼的蛋白。本發(fā)明還公開了一種促進植物葉片生長的方法。本發(fā)明還公開了閩楠PbGRF1基因在促進植物葉片生長中的應用。本申請克隆閩楠PbGRF1基因并通過根癌農桿菌介導花序侵染法轉化擬南芥，獲得閩楠PbGRF1基因過表達植株，通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，過表達閩楠PbGRF1基因的擬南芥比野生型Col葉片面積更大，同時，過表達植株的鮮重和干重也比野生型更重。

技術研發(fā)人員：張俊紅,李霄,倪明陽,張毓婷,童再康
受保護的技術使用者：浙江農林大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2