本發(fā)明屬于免疫學領(lǐng)域，具體涉及雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5、其分泌的單克隆抗體與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬鼻支原體(mycoplasma?hyorhinis，mhr)是一種無細胞壁、能自我復制的原核微生物。豬鼻支原體感染率極高，普遍存在于病豬的鼻腔、氣管和支氣管分泌物中，主要通過飛沫和直接接觸傳播。豬鼻支原體感染可引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等癥狀，常與其他病原混合感染，增加了疾病的治療難度，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

2、支原體是實驗室細胞和生物制品領(lǐng)域公認的污染源。nature雜志特別刊文強調(diào)了支原體污染的普遍性和嚴重性，賓夕法尼亞大學的研究人員發(fā)現(xiàn)，支原體污染比我們想象的更加普遍。美國食品和藥物管理局檢測了超過20000例細胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過15％的細胞培養(yǎng)存在支原體污染。德國dsmz(國家菌種保藏中心)的研究表明，440種細胞系(大多是白血病淋巴瘤細胞)中存在28％的比例被支原體污染。在8種常見的支原體污染源中，豬鼻支原體是極其重要的一種細胞和生物制品污染源，不僅嚴重影響科學研究的有序進行，甚至威脅公共衛(wèi)生安全，已成為世界性難題。

3、近年來的研究發(fā)現(xiàn)，豬鼻支原體可以從人類胃癌組織中檢測和直接分離出來。進一步的研究表明，豬鼻支原體的感染與胃癌、肺癌、胰腺癌、大腸癌、前列腺癌等多種腫瘤之間存在明顯的相關(guān)性，對人類健康構(gòu)成了威脅。盡管豬鼻支原體與腫瘤發(fā)生高度相關(guān)，但對其感染、致病機制以及免疫學狀態(tài)還知之甚少。目前，國內(nèi)尚未推出豬鼻支原體的診斷試劑盒，因此亟需建立一種能夠直接檢測豬鼻支原體的方法，以滿足日益增長的豬鼻支原體防控需求。

4、豬鼻支原體無細胞壁結(jié)構(gòu)，其外膜蛋白承擔著豬鼻支原體定殖、感染、致病、與宿主細胞交互等多種重要功能。本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原mhr_0493(cn113461791b)是申請人前期發(fā)現(xiàn)的豬鼻支原體所特有的豬鼻支原體外膜蛋白，為免疫原性蛋白，具有極高的特異性，為豬鼻支原體所特有，可作為豬鼻支原體或其抗體檢測的分子靶標，目前，尚無針對該免疫蛋白制備的單克隆抗體。

5、單克隆抗體具有純度高、重復性好、與抗原結(jié)合特異性強等特點。然而單抗的制備，尤其是雜交瘤細胞的篩選具有偶然性，采用同種免疫原、同種免疫方式、同種篩選方式，同一個人試驗，最后篩選出來的雜交瘤細胞株往往是不同的，所產(chǎn)生抗體的特異性、敏感性、穩(wěn)定性、效價、功能、應(yīng)用范圍等等也存在不確定性，需要經(jīng)過多輪篩選才能獲得好用的單克隆抗體。

6、制備抗豬鼻支原體外膜蛋白的單克隆抗體，可以為闡明豬鼻支原體外膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供有力工具。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，申請人提供了一株雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5，所述的雜交瘤細胞株的保藏編號為cctcc?no:c2024163。

2、本發(fā)明的另一個目的是提供一種雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5分泌的單克隆抗體。

3、本發(fā)明的最后一個目的在于提供了上述雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體的應(yīng)用。

4、為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

5、申請人根據(jù)前期的研究結(jié)果，將mhr_0493蛋白作為抗原，再通過免疫實驗動物、免疫后動物脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞株通過多輪的穩(wěn)定性、效價等篩選，最終獲得了一株雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5，所述雜交瘤細胞株已于2024年05月27日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為：cctcc?no:c2024163，分類命名為：雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5，地址：中國武漢武漢大學。

6、以上所述的雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5，傳代穩(wěn)定，平均染色體數(shù)目是100.8條，分泌的單克隆抗體的重鏈亞型為igg2b，輕鏈亞型為kappa，該單克隆抗體具備阻斷豬鼻支原體與豬肺泡巨噬細胞粘附的能力。

7、本發(fā)明的保護范圍包括：

8、雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5分泌的單克隆抗體。

9、雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體檢測試劑盒中的應(yīng)用。

10、雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體抗原檢測試劑盒中的應(yīng)用。

11、雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體阻斷制劑中的應(yīng)用。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

13、本發(fā)明提供了可特異性識別豬鼻支原體抗原的單克隆抗體，利用單克隆抗體建立的豬鼻支原體elisa、western?blot檢測方法和免疫熒光檢測方法，均能特異性識別豬鼻支原體，具有很強的反應(yīng)活性和特異性。

14、利用該單克隆抗體建立的豬鼻支原體elisa檢測，對豬鼻支原體全菌抗原的最低檢出量為0.7813ng/ml。

15、利用該單克隆抗體建立的免疫熒光檢測，可直接與豬鼻支原體特異性結(jié)合并標記上熒光，在顯微鏡下實現(xiàn)豬鼻支原體的可視化標記與示蹤。

16、單克隆抗體可以阻斷豬鼻支原體與豬肺泡巨噬細胞的粘附定殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

17、單克隆抗體免疫活性好，雜交瘤細胞分泌于上清中抗體的效價高達1×106，純化后的腹水效價高達108。

18、雜交瘤細胞株(hybridoma?cell?line)mhr_0493-5f5傳代穩(wěn)定性，該雜交瘤細胞傳至d90代依然穩(wěn)定。

技術(shù)特征：

1.?雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5，其特征在于，其保藏號為cctcc?no:c2024163。

2.權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。

3.權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體檢測試劑盒中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體抗原檢測試劑盒中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株mhr_0493-5f5或或其分泌的單克隆抗體在制備豬鼻支原體阻斷制劑中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，所述的試劑盒為elisa檢測試劑盒。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于免疫學領(lǐng)域，公開了雜交瘤細胞株Mhr_0493?5F5、其分泌的抗豬鼻支原體單克隆抗體與應(yīng)用。該雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCC?NO:C2024163，能產(chǎn)生針對豬鼻支原體外膜蛋白Mhr_0493的單克隆抗體，Mhr_0493為豬鼻支原體所特有的外膜蛋白。利用該單克隆抗體建立的ELISA方法，僅能特異性識別豬鼻支原體，與其他支原體、細菌和病毒蛋白無交叉反應(yīng)；建立的間接免疫熒光方法，可特異性標記豬鼻支原體，并在顯微鏡下呈現(xiàn)特異性熒光；該單克隆抗體反應(yīng)活性好、效價高、特異性強，還具有阻斷豬鼻支原體與豬肺泡巨噬細胞粘附定殖的能力，為豬鼻支原體的診斷、預防及治療提供了技術(shù)手段。

技術(shù)研發(fā)人員：劉威,宋淇淇,周丹娜,楊克禮,田永祥,葉利穎,袁芳艷,高婷,劉澤文,郭銳,李暢,吳瓊,朱佳佳
受保護的技術(shù)使用者：湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30