本發(fā)明涉及生物分離純化，尤其涉及一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法。

背景技術(shù)：

1、胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是一種由胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的肽類物質(zhì)，屬于一種腸促胰島素，能夠通過多種途徑來控制血糖，在調(diào)節(jié)食欲方面扮演著至關(guān)重要的角色。然而，由于glp-1在體內(nèi)快速降解和短暫生物活性的特性，glp-1本身并不適合直接用于治療糖尿病和肥胖癥。為了克服這一限制，科學(xué)家們開始致力于研究glp-1類似物，旨在獲得更為穩(wěn)定和持久的生物活性。glp-1類似物的廣泛應(yīng)用有望為糖尿病和肥胖癥等代謝性疾病的治療帶來新的希望，從而改善患者的生活質(zhì)量并減輕全球醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

2、近年來，隨著基因工程和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，glp-1類似物的研究也取得了顯著進(jìn)展。通過基因工程技術(shù)，研究人員成功構(gòu)建了能夠大量表達(dá)glp-1類似物的菌株，為其產(chǎn)量的提高打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。然而，由于glp-1類似物在發(fā)酵液中與其他蛋白質(zhì)和雜質(zhì)共存，傳統(tǒng)的分離純化方法存在操作復(fù)雜、產(chǎn)率低和純度不高等問題，制約了其在臨床應(yīng)用中的進(jìn)一步推廣。

3、目前，對發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物分離純化的領(lǐng)域，尚未出現(xiàn)有效可行的技術(shù)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的分離純化，本發(fā)明提供了一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供了一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，包括以下步驟：

4、在0~30℃下，往glp-1類似物發(fā)酵液中添加無機(jī)鹽和親水性有機(jī)溶劑，混懸均勻，調(diào)節(jié)ph為8.5~10.5，離心使體系分相，取上相通過腸激酶酶切后采用反向制備液相色譜法進(jìn)行純化處理；其中：

5、以體系的總質(zhì)量計(jì)，無機(jī)鹽的添加量為10%~35%，親水性有機(jī)溶劑的添加量為15%~40%；

6、無機(jī)鹽選自檸檬酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸鈉中的一種或多種；

7、親水性有機(jī)溶劑選自乙醇、叔丁醇、正丙醇、異丙醇中的一種或多種；

8、glp-1類似物發(fā)酵液的蛋白濃度為9~13mg/ml。

9、作為上述方法的優(yōu)選，無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀。

10、作為上述方法的優(yōu)選，親水性有機(jī)溶劑為乙醇。

11、作為上述方法的優(yōu)選，以體系的總質(zhì)量計(jì)，無機(jī)鹽的添加量為13%~24%。

12、作為上述方法的優(yōu)選，以體系的總質(zhì)量計(jì)，無機(jī)鹽的添加量為13%~17%。

13、作為上述方法的優(yōu)選，以體系的總質(zhì)量計(jì)，親水性有機(jī)溶劑的添加量為16%~26%。

14、作為上述方法的優(yōu)選，調(diào)節(jié)ph為9.5。

15、作為上述方法的優(yōu)選，所述純化處理的方法為：將腸激酶酶切得到的glp-1類似物粗產(chǎn)物溶解于tris緩沖液后，上樣于反向制備液相色譜柱，收集21min出峰位置的峰產(chǎn)物，其中：反向制備液相色譜分離的流動(dòng)相為：a(含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）tfa的水)、b(0.1%tfa（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈)；樣品上樣溶液為10%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈溶液；色譜柱為?sepax?bio-c8（10μm，21.2*250mm）；洗脫條件為：0-5?min，5%b；5-5.5min，5-30%b；5.5-30?min，30%-80%b；30-30.5min，80-100%b；30.5-35min，100%b；35-35.5min，100-5%b；35.5-40?min，5%?b；然后下一批循環(huán)。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

17、（1）本發(fā)明針對glp-1類似物發(fā)酵液，通過調(diào)節(jié)親水性有機(jī)溶劑和可溶性無機(jī)鹽之間的比例，形成兩個(gè)水相層，從而實(shí)現(xiàn)了glp-1類似物的高效富集，為glp-1類似物的分離純化提供了一條全新的技術(shù)途徑，進(jìn)一步地，高效富集后的粗產(chǎn)物可以通過反向制備液相色譜法進(jìn)行純化處理，得到高純度的glp-1類似物。本發(fā)明提供的方法填補(bǔ)了發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物分離純化領(lǐng)域的技術(shù)空白。

18、（2）本發(fā)明還針對能實(shí)現(xiàn)glp-1類似物發(fā)酵液的高效富集的雙水相萃取體系，給出了最優(yōu)的萃取條件，比如，優(yōu)選的親水性有機(jī)溶劑和可溶性無機(jī)鹽、優(yōu)選的ph條件、優(yōu)選的溫度條件、優(yōu)選的蛋白濃度條件等，使發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的分離純化效果達(dá)到最優(yōu)化。

技術(shù)特征：

1.一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀。

3.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：親水性有機(jī)溶劑為乙醇。

4.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：以體系的總質(zhì)量計(jì)，無機(jī)鹽的添加量為13%~24%。

5.如權(quán)利要求4所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：以體系的總質(zhì)量計(jì)，無機(jī)鹽的添加量為13%~17%。

6.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：以體系的總質(zhì)量計(jì)，親水性有機(jī)溶劑的添加量為16%~26%。

7.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：調(diào)節(jié)ph為9.5。

8.如權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中g(shù)lp-1類似物的方法，其特征在于：所述純化處理的方法為：將腸激酶酶切得到的glp-1類似物粗產(chǎn)物溶解于tris緩沖液后，上樣于反向制備液相色譜柱，收集21min出峰位置的峰產(chǎn)物，其中：反向制備液相色譜分離的流動(dòng)相為：a(含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）tfa的水)、b(0.1%tfa（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈)；樣品上樣溶液為10%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈溶液；色譜柱為?sepax?bio-c8（10μm，21.2*250mm）；洗脫條件為：0-5?min，5%b；5-5.5min，5-30%b；5.5-30?min，30%-80%b；30-30.5min，80-100%b；30.5-35min，100%b；35-35.5min，100-5%b；35.5-40?min，5%?b；然后下一批循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物分離純化技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種雙水相萃取耦合反相柱層析分離純化發(fā)酵液中GLP?1類似物的方法。針對GLP?1類似物發(fā)酵液，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)親水性有機(jī)溶劑和可溶性無機(jī)鹽之間的比例，形成兩個(gè)水相層，從而實(shí)現(xiàn)了GLP?1類似物的高效富集，為GLP?1類似物的分離純化提供了一條全新的技術(shù)途徑，進(jìn)一步地，高效富集后的粗產(chǎn)物可以通過反向制備液相色譜法進(jìn)行純化處理，得到高純度的GLP?1類似物。本發(fā)明提供的方法簡單高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)，填補(bǔ)了發(fā)酵液中GLP?1類似物分離純化的技術(shù)空白。

技術(shù)研發(fā)人員：項(xiàng)寧,邢醴天,余亞希,鄒子楠,徐紹興,王旭東
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2