本發(fā)明屬于分子生物，具體涉及一種用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的引物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、甘蔗近緣屬資源豐富，具有生物量高、分蘗力強(qiáng)、宿根性好和抗旱、耐澇、耐瘠、抗病蟲能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。甘蔗育種中通過甘蔗野生種質(zhì)材料與甘蔗進(jìn)行雜交，具有獲得高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)的甘蔗新品種潛力。斑茅是甘蔗遺傳改良育種中備受關(guān)注的近緣屬野生種之一，經(jīng)過十幾年的雜交利用，現(xiàn)已獲得多個(gè)含有斑茅血緣的優(yōu)質(zhì)雜交親本和栽培登記品種。染色體是基因的載體，為了進(jìn)一步利用斑茅的優(yōu)良特性，需要了解其后代染色體組成。目前可對(duì)甘蔗染色體進(jìn)行鑒定的方法主要有基因組原位雜交(genomic?in?situ?hybridization,gish)和分子標(biāo)記。通過gish可以準(zhǔn)確地標(biāo)記染色體，直觀的體現(xiàn)異源染色體和染色質(zhì)的分布和變化。利用gish可研究甘蔗有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體遺傳情況及分析甘蔗不同來源染色體構(gòu)成。wang等人借助gish分析揭示了中國櫻桃和二倍體近緣種之間的基因組關(guān)系。除gish之外，近幾年興起的oligo-fish技術(shù)也是鑒定和精確識(shí)別染色體的重要細(xì)胞手段，其是利用寡聚核苷酸合成探針，攜帶熒光的探針與細(xì)胞的染色體進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而對(duì)染色體進(jìn)行標(biāo)記的一種技術(shù)方法，相對(duì)gish而言oligo探針更有特異性，通過構(gòu)建的染色體物理圖譜可以識(shí)別具體的某段染色體及染色體易位情況，分析染色體遺傳規(guī)律。jiang通過chorus2軟件設(shè)計(jì)并合成oligo探針，對(duì)玉米、土豆、和小麥等多個(gè)植物進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在遺傳過程中均出現(xiàn)不同程度的染色體重排。特異性重復(fù)序列可以制備成探針對(duì)染色體進(jìn)行識(shí)別，特異性重復(fù)序列可以制備成探針對(duì)染色體進(jìn)行識(shí)別，huang等人挖掘到割手密特異的著絲粒重復(fù)序列，將其制備成探針對(duì)割手密進(jìn)行染色體進(jìn)行標(biāo)記鑒定。但gish、oligo-fish以及重復(fù)序列原位雜交技術(shù)需要具有豐富的細(xì)胞遺傳學(xué)經(jīng)驗(yàn)才能獲得好的實(shí)驗(yàn)效果，并且，gish是利用甘蔗莖的根尖分生區(qū)細(xì)胞中期細(xì)胞染色體進(jìn)行檢測(cè)，甘蔗成熟通常需要半年到一年的時(shí)間。因此，利用細(xì)胞學(xué)手段無法達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

2、為了快速鑒定和分析甘蔗染色體組成，yang等利用its序列分析，發(fā)現(xiàn)不同物種間存在多個(gè)snp位點(diǎn)，并開發(fā)出可以鑒定熱帶種和割手密的特異引物。莊南生等通過回收aflp擴(kuò)增產(chǎn)物分離出斑茅基因組特異序列，并將其轉(zhuǎn)化為scar分子標(biāo)記，可用于跟蹤甘蔗與斑茅雜交后代中的斑茅染色體或片段。在甘蔗研究中使用分子標(biāo)記，如ssr和基因微衛(wèi)星，已被證明對(duì)育種項(xiàng)目中的抗病性鑒定、遺傳多樣性分析和標(biāo)記輔助選擇至關(guān)重要。目前可以對(duì)斑茅9號(hào)染色體進(jìn)行直接鑒定的分子標(biāo)記尚未開發(fā)，所以開發(fā)出可以對(duì)斑茅9號(hào)染色體分子標(biāo)記具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)目前沒有可以直接鑒定斑茅9號(hào)染色體的分子鑒定方法，提供一種用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的引物、試劑盒及方法。利用斑茅特異序列pcr引物tachr09-f/r快速鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，可通過pcr結(jié)果直觀反映所檢測(cè)的甘蔗材料有無斑茅9號(hào)染色體，促進(jìn)斑茅種質(zhì)資源在甘蔗遺傳改良中的廣泛應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的引物，所述引物的序列為：

3、tachr09-f：5'-catatcagtattcgtgttctcaaatttc-3'(seq?id?no.1)；

4、tachr09-r：5'-gtaaaacataggctaggacattaaac-3'(seq?id?no.2)。

5、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的引物在制備用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的試劑盒中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種試劑盒，其包括上述的引物。

7、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述的引物或試劑盒在鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述的引物或試劑盒在甘蔗種質(zhì)資源改良或甘蔗育種中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種快速鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的方法，包括以下步驟：

10、(1)提取甘蔗材料的基因組dna；

11、(2)以提取的基因組dna為模板，使用上述tachr09-f/r引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

12、(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體。

13、步驟(2)中，所述pcr的反應(yīng)體系包括：2×pcr?mix?12.5μl、tachr09-f?2μl、tachr09-r2μl、100ng/μl的模版dna?2μl和ddh2o?6.5μl，共25μl。

14、步驟(2)中，所述pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)35次；72℃終延伸3min，4℃保存。

15、步驟(3)中，所述根據(jù)電泳結(jié)果判斷甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，具體為：如獲大小為1006bp的條帶，則判定甘蔗材料中含有斑茅9號(hào)染色體，若未獲得1006bp的條帶則判定甘蔗材料中不含有斑茅9號(hào)染色體。

16、本發(fā)明具有以下有益效果：

17、(1)效率高：應(yīng)用本發(fā)明方法可以快速檢測(cè)甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，只需提取幼苗葉片dna檢測(cè)即可。

18、(2)穩(wěn)定性好：隨著斑茅在甘蔗育種中的利用，較高世代的甘蔗與斑茅雜交后代真實(shí)性的鑒定還未見較穩(wěn)定的分子標(biāo)記用于檢測(cè)，而本發(fā)明方法經(jīng)過前期試驗(yàn)，可穩(wěn)定檢測(cè)甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，穩(wěn)定性較好。

19、(3)費(fèi)用低：采用普通的pcr技術(shù)即可檢測(cè)甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體。

20、(4)操作簡(jiǎn)便：前期只需要通過提取基因組dna，再通過普通的pcr擴(kuò)增檢測(cè)即可。

21、(5)推廣性好：本發(fā)明實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好。

技術(shù)特征：

1.用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的引物，其特征在于，所述引物的序列為：

2.權(quán)利要求1所述的引物在制備用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的試劑盒中的應(yīng)用。

3.一種試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物。

4.權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求3所述的試劑盒在鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求3所述的試劑盒在甘蔗種質(zhì)資源改良或甘蔗育種中的應(yīng)用。

6.一種快速鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr的反應(yīng)體系包括：2×pcr?mix12.5μl、tachr09-f?2μl、tachr09-r?2μl、100ng/μl的模版dna?2μl和ddh2o?6.5μl，共25μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)電泳結(jié)果判斷甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，具體為：如獲大小為1006bp的條帶，則判定甘蔗材料中含有斑茅9號(hào)染色體，若未獲得1006bp的條帶則判定甘蔗材料中不含有斑茅9號(hào)染色體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了用于鑒定甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體的引物、試劑盒及方法。本發(fā)明方法利用斑茅特異序列PCR引物TaChr09?F/R(序列如SEQ?ID?NO.1?2所示)通過常規(guī)普通的PCR反應(yīng)程序就能穩(wěn)定檢測(cè)甘蔗材料是否含有斑茅9號(hào)染色體，該方法具有效率高、穩(wěn)定性好、費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)便和推廣性好的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于甘蔗種質(zhì)資源改良或甘蔗育種。

技術(shù)研發(fā)人員：李雪停,鄧祖湖,雷亞文,郭藝榮,張南南,凌秋平,吳嘉云
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6