(一)本發(fā)明涉及表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆事件及其鑒定方法，具體涉及含人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3和用于檢測生物樣品中是否含轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的核酸序列及其方法。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、乳鐵蛋白是一種天然的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，于1939年首次在牛奶中發(fā)現(xiàn)。乳鐵蛋白主要由哺乳動物黏膜上皮細(xì)胞合成和分泌，廣泛存在于乳汁中，也存在于淚液、唾液、血漿、胰液、膽汁等內(nèi)外分泌液中。乳鐵蛋白含量在不同哺乳階段乳汁中存在差異，初乳中乳鐵蛋白含量較高，例如人初乳中乳鐵蛋白含量為1.5-10.1mg/ml，而常乳中乳鐵蛋白含量僅為2.0-3.3mg/ml(wang?b,timilsena?y,blanch?e,et?al.lactoferrin:structure,function,denaturation?and?digestion.critical?reviews?in?food?science&nutrition,2017(2):00-00)。此外，乳鐵蛋白含量在不同物種間差異也較大，例如牛初乳中乳鐵蛋白含量(0.28–1.36mg/ml)較人初乳中的低，牛常乳中的乳鐵蛋白含量更低，僅為0.03-0.49mg/ml(krolitzki?e,schwaminger?s,pagel?m,et?al.current?practices?withcommercial?scale?bovine?lactoferrin?production?and?alternative?approaches,international?dairy?journal,2022(126)105263)。山羊、駱駝、豬、馬、兔、狗等動物的乳汁中也有少量乳鐵蛋白，但乳鐵蛋白的主要來源還是人乳與牛乳。

2、乳鐵蛋白具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝、增強(qiáng)抗菌抗病毒能力、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等作用，因此廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品保健、飼料工業(yè)等領(lǐng)域，需求量較大。人乳鐵蛋白是理想的嬰兒食品補(bǔ)充劑，但很少有工業(yè)化生產(chǎn)的人乳鐵蛋白可供使用。目前，市售的乳鐵蛋白主要是從牛奶或甜乳清中分離出來的，需要采用離子交換色譜法、鹽析法、超濾法以及多種方法結(jié)合使用。這些分離純化工藝成本高昂，且需要大量的原料。因此，探索一種低成本生產(chǎn)乳鐵蛋白尤其是人乳鐵蛋白的方法具有重大意義。

3、近年來，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器表達(dá)重組蛋白已極具吸引力。植物生物反應(yīng)器具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)高等植物能合成有活性的來自真核生物的蛋白；2)植物種子具有高蛋白含量、低蛋白酶活性和低水分含量，有利于重組蛋白的穩(wěn)定；3)容易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模、種植成本低、環(huán)境可持續(xù)。大豆是主要農(nóng)作物之一，目前也被用作生物反應(yīng)器。與其他作物相比，大豆具有以下優(yōu)勢：一是自花授粉作物，具有遺傳穩(wěn)定性；二是大豆的根瘤菌有固氮作用，可以減少對化肥的需求；三是大豆蛋白質(zhì)含量豐富，約為40％，具有很高的合成潛力。

4、轉(zhuǎn)基因事件或轉(zhuǎn)化事件是由t-dna隨機(jī)整合到植物基因組上而產(chǎn)生的，由于t-dna插入的位置是隨機(jī)的，因此獲得的每個轉(zhuǎn)基因事件都是獨(dú)特的。轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)受其所在染色體位置的影響，位置不同，即使是來自同一轉(zhuǎn)化載體的不同轉(zhuǎn)化事件，外源基因的表達(dá)水平、表達(dá)時間和空間模式上會呈現(xiàn)出較大差異，甚至對植物農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響。因此，需要創(chuàng)建和篩選大量轉(zhuǎn)化事件，才能夠篩選獲得高效表達(dá)外源基因、不影響植株農(nóng)藝性狀、滿足生產(chǎn)需要的優(yōu)秀轉(zhuǎn)化事件。

5、轉(zhuǎn)化事件外源基因整合位點(diǎn)信息是轉(zhuǎn)化事件獨(dú)有的身份特征，對轉(zhuǎn)基因作物的雜交育種、生產(chǎn)應(yīng)用和監(jiān)管上具有重要價值。通過轉(zhuǎn)化事件外源基因整合位點(diǎn)信息，才能借助現(xiàn)有的多核苷酸檢測方法來檢測植物中轉(zhuǎn)化事件的存在。常規(guī)的多核苷酸和蛋白檢測方法可以檢測植物中是否存在目的基因或目的蛋白，但無法有效區(qū)分不同的轉(zhuǎn)化事件，特別是使用相同轉(zhuǎn)化載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化事件。因此，只有針對插入基因和側(cè)翼序列的檢測才能準(zhǔn)確判斷是否存在目標(biāo)轉(zhuǎn)基因事件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種高表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3及其檢測方法和應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3同時表達(dá)人乳鐵蛋白和cp4?epsps兩種蛋白，具有很高的乳鐵蛋白含量，遺傳穩(wěn)定且對農(nóng)藝性狀沒有明顯不良影響；所述表達(dá)cp4?epsps蛋白的基因cp4?epsps僅作為篩選標(biāo)記使用；本發(fā)明還提供了檢測所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的方法，所述方法可快速準(zhǔn)確檢測出生物樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的dna分子。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種高表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3，所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3包含外源插入序列，所述外源插入序列以seq?id?no:10所示的核苷酸序列為左側(cè)翼區(qū)，以seq?id?no:11所示的核苷酸序列為右側(cè)翼區(qū)。

4、進(jìn)一步，所述外源插入序列包含兩個人乳鐵蛋白基因表達(dá)框和一個耐草甘膦基因表達(dá)框；人乳鐵蛋白基因表達(dá)框編碼人乳鐵蛋白hlf蛋白，其中一個表達(dá)框中hlf蛋白由pgm2s-1啟動子啟動，終止子為athsp18.2終止子，另一個表達(dá)框中hlf蛋白由pgy5啟動子啟動，終止子為nos終止子，啟動子與hlf蛋白之間均連接at2s2信號肽和tev?5’utr；耐草甘膦基因表達(dá)框編碼耐草甘膦的cp4?epsps蛋白，由pcamv35s啟動子啟動，終止子為camv35s終止子，啟動子與cp4?epsps蛋白之間連接ctp轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和tev?5’utr；兩個人乳鐵蛋白基因表達(dá)框和一個耐草甘膦基因表達(dá)框彼此設(shè)置mar序列。

5、進(jìn)一步，所述外源插入序列核苷酸序列如seq?id?no:9中1001-14834所示。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的核酸序列，所述核酸序列包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列。

7、所述seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3插入序列5’端整合位點(diǎn)附近的一個長度為50個核苷酸的序列，所述seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列跨越了側(cè)翼基因組序列和插入序列的5’端dna序列，包含所述seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的存在。

8、所述seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3插入序列3’端整合位點(diǎn)附近的一個長度為50個核苷酸的序列，所述seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列跨越了側(cè)翼基因組序列和插入序列的3’端dna序列，包含所述seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的存在。

9、進(jìn)一步，所述核酸序列包含seq?id?no:3-8或其互補(bǔ)序列中的一種或多種。

10、所述seq?id?no:3、5、7或其互補(bǔ)序列跨越了側(cè)翼基因組序列和插入序列的5’端dna序列，包含所述seq?id?no:3、5、7或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的存在。

11、所述seq?id?no:4、6、8或其互補(bǔ)序列跨越了側(cè)翼基因組序列和插入序列的3’端dna序列，包含所述seq?id?no:4、6、8或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的存在。

12、更進(jìn)一步地，所述核酸序列包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列。seq?id?no:9包括插入序列和插入序列的左、右側(cè)翼區(qū)，長度為15834個核苷酸，其具體包含的基因組和遺傳元件如表1所示。包含所述seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的存在。

13、所述核酸序列源自包含轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的植物、種子或細(xì)胞。

14、本發(fā)明還提供一種含有轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的重組載體或重組細(xì)胞，其含有所述外源插入序列(seq?id?no:9中1001-14834)。

15、本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法，將含有人乳鐵蛋白和耐草甘膦基因表達(dá)框的外源t-dna序列導(dǎo)入大豆基因組中，通過再生含有外源基因的大豆細(xì)胞獲得大豆轉(zhuǎn)基因群體，并利用分子生物學(xué)和生物測定的方法篩選得到能夠滿足生產(chǎn)需要的大豆轉(zhuǎn)化事件。通過自交或雜交等方式獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的后代，任意后代的基因組中插入序列的旁側(cè)序列為seq?id?no:10或seq?id?no:11的大豆事件和種子都應(yīng)視為本發(fā)明的一方面。

16、第三方面，本發(fā)明提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的特異性引物對，所述引物對包含第一引物和不同于第一引物的第二引物，所述第一引物包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸，所述第二引物包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸。

17、進(jìn)一步，所述第一引物包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)基因插入序列區(qū)域內(nèi)任意11個及以上的連續(xù)多核苷酸，所述第二引物包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列中5’或3’側(cè)翼基因組內(nèi)任意11個及以上的連續(xù)多核苷酸。

18、更進(jìn)一步，所述第一引物核苷酸序列如seq?id?no:13或seq?id?no:15所示，所述第二引物核苷酸序列如seq?id?no:12或seq?id?no:14所示。

19、第四方面，本發(fā)明提供一種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的dna存在的方法，所述方法包括：

20、1)使待檢測樣品與所述特異性引物對接觸；

21、2)進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)；

22、3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在；檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，則待測樣品中存在轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的dna；所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列。

23、進(jìn)一步，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含seq?id?no:3-8或其互補(bǔ)序列之一。

24、更進(jìn)一步，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含seq?id?no:9或其互補(bǔ)序列。

25、所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離和觀察，或?qū)ζ溥M(jìn)行測序分析。

26、所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測還可通過將所述引物對和寡核苷酸探針結(jié)合的方法，所述寡核苷酸探針可被熒光標(biāo)記(例如6-famtm熒光標(biāo)記)，所述寡核苷酸探針選自seq?id?no:1-9或其互補(bǔ)序列。

27、第五方面，本發(fā)明提供了一種利用所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，所述方法為：種植含特定區(qū)域核苷酸序列的大豆種子，收獲高表達(dá)人乳鐵蛋白的大豆，分離提取得到人乳鐵蛋白；所述特定區(qū)域核苷酸序列來自轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3，所述特定區(qū)域核苷酸序列包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列。

28、第六方面，本發(fā)明提供了一種培育含所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的表達(dá)人乳鐵蛋白大豆植物的方法，所述方法包括：將含有特定區(qū)域核苷酸序列的大豆植株與另一種大豆雜交，產(chǎn)生后代植株并收獲，與不含特定區(qū)域核苷酸序列的大豆相比，收獲后代植株中人乳鐵蛋白含量顯著提高的植株。所述特定區(qū)域核苷酸序列來自轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3，所述特定區(qū)域核苷酸序列包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列。

29、所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的后代包括植物或種子或植物部分和種子；所述植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、花瓣、莖、葉、種子、莢和分生組織。

30、第七方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)自轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是將所述轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的特定區(qū)域核酸序列轉(zhuǎn)入植物基因組獲得的，所述特定區(qū)域核酸序列包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列。

31、第八方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)自轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3的農(nóng)產(chǎn)品或加工品，所述農(nóng)產(chǎn)品或加工品包含特定區(qū)域核苷酸序列，所述特定區(qū)域核苷酸序列包含seq?id?no:1或其互補(bǔ)序列、和/或seq?id?no:2或其互補(bǔ)序列；所述加工品包括但不限于：大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆坯片、大豆豆皮、大豆干酪、包含大豆的動物飼料、以及使用大豆植物及大豆植物部分生產(chǎn)的燃料產(chǎn)品。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

33、本發(fā)明提供了一個轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3，該事件能夠高水平表達(dá)人乳鐵蛋白，具有很高的乳鐵蛋白含量，乳鐵蛋白含量高達(dá)6.12mg/g，遠(yuǎn)高于牛初乳中的乳鐵蛋白含量，也高于人常乳中的乳鐵蛋白含量；且對植株的生長、發(fā)育及農(nóng)藝性狀沒有明顯不良影響。

34、所述轉(zhuǎn)基因大豆事件可作為生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)人乳鐵蛋白，填補(bǔ)人乳鐵蛋白在嬰幼兒食品補(bǔ)充劑市場中的空白，利用所述轉(zhuǎn)基因大豆分離純化乳鐵蛋白具有種植成本低、容易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有顯著的成本優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。

35、同時，本發(fā)明提供了檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件hlaf-3dna存在的方法，對實(shí)現(xiàn)大豆事件hlaf-3的溯源和監(jiān)管具有重要意義。