本說明書涉及基因工程，尤其涉及一種水稻pp2c06基因敲除在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、種子是人類生存的重要保障。它是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最基本生產(chǎn)資料，其豐富的儲藏物，淀粉、蛋白和脂肪等為人類提供重要的食物來源。在種子貯藏過程中，不可避免地會發(fā)生老化，進而導致種子品質(zhì)下降，最終影響其食用性甚至無法食用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子的老化將直接導致種子無法發(fā)芽成苗，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因而，延長種子的貯藏時間，具有十分重要的理論和實踐意義。

2、水稻是我國最主要的糧食作物之一。在農(nóng)作物中，水稻種子貯藏時間相對較短，嚴重影響其生產(chǎn)應(yīng)用價值。迄今，關(guān)于水稻種子貯藏時間的分子調(diào)控機制仍舊知之甚少，僅少數(shù)控制種子貯藏時間的基因被克隆，包括bzip23、per1a、rc、glyi3、pimt、msrb5等。aba在調(diào)控種子貯藏時間中起到至關(guān)重要的作用。擬南芥aba合成缺失突變體aba1-5和aba不敏感突變體abi3相對野生型種子壽命顯著降低。abi3和lec1、lec2以及fus3組成lafl轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體調(diào)控種子的發(fā)育過程，其中l(wèi)ec1同abi3一樣還正調(diào)控種子貯藏時間。另外，在擬南芥中，aba信號核心組分snrk2蛋白三重突變體的種子貯藏時間大幅度縮短。然而，在水稻中關(guān)于aba調(diào)控種子貯藏時間的基因鮮有報道。因此，發(fā)掘并鑒定aba控制水稻種子貯藏時間的基因資源，深入探索其分子調(diào)控機制，對于水稻高品質(zhì)分子育種具有十分重要的理論指導意義。

3、基于此，本說明書提供一種水稻pp2c06基因敲除在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本說明書實施例提供一種水稻pp2c06基因敲除在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用，用于解決以下技術(shù)問題：目前，在水稻中關(guān)于aba調(diào)控種子貯藏時間的基因鮮有報道，嚴重限制了對種子貯藏時間的分子調(diào)控機制和基因網(wǎng)絡(luò)的理解。

2、為解決上述技術(shù)問題，本說明書實施例是這樣實現(xiàn)的：

3、本說明書實施例提供的基因敲除突變體在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻pp2c06基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；

4、所述基因敲除為利用crispr/cas9技術(shù)，對水稻pp2c06基因進行靶向敲除，獲得基因敲除突變體。

5、進一步地，所述基因敲除突變體的基因敲除靶點位于水稻pp2c06基因的第二外顯子，起始位點位于1092bp。

6、進一步地，所述基因敲除突變體為水稻pp2c06基因的1109bp處插入1個堿基，導致氨基酸序列在258aa處發(fā)生改變，并在296aa處提前終止；

7、和/或

8、所述基因敲除突變體為水稻pp2c06基因的1109bp處敲除1個堿基，導致氨基酸序列在257aa處提前終止。

9、進一步地，所述基因敲除突變體的敲除靶標位點序列如seq?id?no:2所示。

10、進一步地，用于檢測所述基因敲除突變體的引物序列如seq?id?no:3-4所示。

11、進一步地，所述基因敲除突變體通過如下方法獲得：

12、基于sgrna表達盒以及水稻pp2c06基因設(shè)計敲除靶點，構(gòu)建靶標sgrna表達盒；

13、基于所述靶標sgrna表達盒及crispr/cas9基因敲除系統(tǒng)，構(gòu)建基因敲除表達載體；

14、采用農(nóng)桿菌介導的方法，將所述基因敲除表達載體轉(zhuǎn)化水稻品種，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株；

15、利用檢測引物序列，鑒定t0代轉(zhuǎn)基因水稻植株，獲得所述基因敲除突變體。

16、進一步地，所述檢測引物序列如seq?id?no:5-6。

17、進一步地，所述水稻品種為中花11。

18、進一步地，所述基因敲除突變體的種子的外觀表型及貯藏前的發(fā)芽率與野生型受體親本水稻植株一致。

19、進一步地，所述基因敲除突變體的種子貯藏時間比野生型受體親本水稻植株的種子貯藏時間長。

20、本說明書實施例采用的上述至少一個技術(shù)方案能夠達到以下有益效果：利用crispr/cas9技術(shù)敲除水稻pp2c06基因，獲得基因敲除突變體，該基因敲除突變體的外觀表型及貯藏前的發(fā)芽率并不發(fā)生變化，但是能夠顯著延長水稻種子貯藏時間，為解決水稻種子貯藏時間短的問題提供新的理論和技術(shù)，也為高品質(zhì)分子育種實踐提供全新的基因資源，能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，具有重要的實踐意義和農(nóng)業(yè)利用價值。

技術(shù)特征：

1.水稻pp2c06基因敲除在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻pp2c06基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因敲除突變體的基因敲除靶點位于水稻pp2c06基因的第二外顯子，起始位點位于1092bp。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，

4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因敲除突變體的敲除靶標位點序列如seq?id?no:2所示。

5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于檢測所述基因敲除突變體的引物序列如seq?id?no:3-4所示。

6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因敲除突變體通過如下方法獲得：

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測引物序列如seq?id?no:5-6。

8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻品種為中花11。

9.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因敲除突變體的種子的外觀表型及貯藏前的發(fā)芽率與野生型受體親本水稻植株一致。

10.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因敲除突變體的種子貯藏時間比野生型受體親本水稻植株的種子貯藏時間長。

技術(shù)總結(jié)
本說明書實施例公開了水稻PP2C06基因敲除在調(diào)控水稻種子貯藏時間中的應(yīng)用。本說明書利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻PP2C06基因第二外顯子上的靶點，獲得基因敲除突變體，該基因敲除突變體的外觀表型及貯藏前的發(fā)芽率并不發(fā)生變化，但是能夠顯著延長水稻種子貯藏時間，為解決水稻種子貯藏時間短的問題提供新的理論和技術(shù)，也為高品質(zhì)分子育種實踐提供全新的基因資源，能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，具有重要的實踐意義和農(nóng)業(yè)利用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：王偉青,宋獻軍,高瓊
受保護的技術(shù)使用者：中國科學院植物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6