本發(fā)明涉及固定化酶催化纖維素水解，特別涉及一種以竹子為原材料的磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、當(dāng)下，世界對能源的需求仍然巨大，而環(huán)境污染日益嚴(yán)重等原因下，不同類型的可持續(xù)發(fā)展的新能源逐漸被人們所重視，成為當(dāng)下的研究熱點。生物質(zhì)能是一種可以通過光合作用合成天然纖維素，再利用太陽能轉(zhuǎn)換為植物儲存的生物能的一種新的能源形式，具有龐大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ举|(zhì)纖維素高效酶解制備還原糖是生物質(zhì)高值化利用的研究熱點之一。

2、木質(zhì)纖維素具有來源廣、再生周期短、含碳量低等特點，是生產(chǎn)生物質(zhì)基材料、液體燃料和高附加值化學(xué)品的理想原料。其經(jīng)不完全碳化制備的高性能生物碳具有吸附性強、孔結(jié)構(gòu)可調(diào)、生物相容性好、回收簡便等優(yōu)點，是固定化酶的優(yōu)良載體。因此，以生物碳為載體實現(xiàn)纖維素酶的高效固定化，探討生物碳固定化纖維素酶的水解效率和重復(fù)利用率，有利于促進(jìn)生物質(zhì)資源的高效利用及相關(guān)酶產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

3、木質(zhì)纖維素水解常用的酶是纖維素酶，是一種可將纖維素分解成寡糖和單糖的蛋白質(zhì)。纖維素酶的穩(wěn)定性和活力是木質(zhì)纖維素糖化工藝的關(guān)鍵影響因素，其受反應(yīng)體系、反應(yīng)環(huán)境等多因素影響，且提高纖維素酶回收利用性能是降低相關(guān)產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)成本的主要途徑之一。為了提高酶解效率，一般需破壞木質(zhì)素和半纖維素的結(jié)合層，降低纖維素的結(jié)晶度，減少木質(zhì)素的含量，控制抑制劑的生成，并且需要選擇適宜的ph值和酶解溫度。

4、固定化酶技術(shù)是一種始于20世紀(jì)60年代的生物工程技術(shù)，其能有效提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。根據(jù)載體的組成，固定化酶載體可分為有機載體、無機載體和金屬有機骨架載體。生物炭材料屬于無機載體材料，在具有其本身載體性質(zhì)即穩(wěn)定性好、機械強度高、成本低等優(yōu)點的同時與金屬有機骨架材料相似，擁有結(jié)構(gòu)可控、比表面積和孔徑大、生物相容性好等優(yōu)點。而毛竹具有生長迅速、環(huán)境適應(yīng)性強的特點，使用毛竹為原材料制備磁性生物炭擁有原料充足，政策支持，成本較低等優(yōu)點，有利于可持續(xù)發(fā)展的經(jīng)濟效益和環(huán)境優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物的制備方法。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供所述方法制備得到的磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物。

3、本發(fā)明的再一目的在于提供所述磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

5、一種磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

6、（1）“共價沉淀法”制備磁性生物炭

7、①將竹粉生物炭、鐵鹽和無水乙醇混合均勻，得到磁性生物炭前驅(qū)體；其中，鐵鹽為二價鐵鹽和三價鐵鹽組成的混合物；

8、②在保護(hù)性氣體氛圍下，將步驟①中得到的磁性生物炭前驅(qū)體升溫至300～500℃進(jìn)行熱解，待熱解完成后自然冷卻，再取出研磨、洗滌，得到竹粉磁性生物炭；

9、（2）制備磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物

10、③將步驟②中得到的竹粉磁性生物炭與聚醚酰亞胺（pei）超聲分散到水中，然后在60±5℃條件下震蕩反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵收集材料，洗滌，干燥，得到氨基改性后的竹粉磁性生物炭；

11、④將步驟②中得到的竹粉磁性生物炭或步驟③中得到的氨基改性后的竹粉磁性生物炭與戊二醛（gda）溶液混合反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后洗滌，以去除未反應(yīng)的戊二醛，得到活化后的磁性生物炭；

12、⑤將步驟④中得到的活化后的磁性生物炭與纖維素酶溶液混合均勻，通過化學(xué)結(jié)合固定，再將獲得的產(chǎn)物通過磁性分離，洗滌，得到磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物。

13、步驟①中所述的竹粉生物炭為以竹子為原料制備竹粉生物炭；優(yōu)選為通過如下方法制備得到：

14、將竹子粉碎，得到竹粉；然后將竹粉與koh混合后加水溶解，再將混合好的物料烘干后在保護(hù)性氣體范圍下升溫至300～500℃進(jìn)行熱解（活化），待熱解結(jié)束后洗滌至中性，烘干，得到竹粉生物炭。

15、所述的竹子優(yōu)選為毛竹；進(jìn)一步優(yōu)選為3年生毛竹。

16、所述的粉碎為粉碎至40～100目；優(yōu)選為粉碎至60目。

17、所述的竹粉與koh的質(zhì)量比優(yōu)選為1:2。

18、所述的竹粉與水的質(zhì)量比優(yōu)選為1:10。

19、所述的保護(hù)性氣體為n2，其流速20?ml/min。

20、所述的升溫的速率優(yōu)選為5?℃/min。

21、所述的熱解的條件優(yōu)選為：溫度500?℃，停留時間60?min。

22、所述的洗滌為采用去離子水進(jìn)行洗滌。

23、步驟①中所述的二價鐵鹽和三價鐵鹽的摩爾比為1:2。

24、步驟①中所述的二價鐵鹽優(yōu)選為fecl2·4h2o（四水合氯化亞鐵）。

25、步驟①中所述的三價鐵鹽優(yōu)選為fecl3·6h2o（六水合氯化鐵）。

26、步驟①中所述的竹粉生物炭的用量為按每摩爾二價鐵鹽配比1g竹粉生物炭計算。

27、步驟①中所述的無水乙醇的用量為按每克竹粉生物炭配比15～30ml無水乙醇計算；優(yōu)選為按每克竹粉生物炭配比20ml無水乙醇計算。

28、步驟②中所述的保護(hù)性氣體優(yōu)選為氮氣。

29、步驟②中所述的升溫的速率為8～12℃/min；優(yōu)選為10?℃/min。

30、步驟②中所述的熱解的方式優(yōu)選為：先升溫至65～75℃保持8～12分鐘，然后繼續(xù)升溫至300～500℃保持50～70分鐘；進(jìn)一步優(yōu)選為：先升溫至70?℃保持10分鐘，然后繼續(xù)升溫至500℃并保持60分鐘。

31、步驟③中所述的聚醚酰亞胺（pei）的重均分子量10000～20000；優(yōu)選為10000。

32、步驟③中所述的竹粉磁性生物炭與聚醚酰亞胺（pei）的質(zhì)量比為1:5～10；優(yōu)選為1:5或1：10；更優(yōu)選為1:5。

33、步驟③中所述的水的用量為按每克竹粉磁性生物炭配比15～30?ml水計算；優(yōu)選為按每克竹粉磁性生物炭配比20?ml水計算。

34、步驟③中所述的水為去離子水。

35、步驟③中所述的超聲分散的時間可根據(jù)實際需要進(jìn)行設(shè)置，優(yōu)選為10?min。

36、步驟③中所述的反應(yīng)的時間為20～30?h；優(yōu)選為24?h。

37、步驟③中所述的洗滌為采用去離子水和乙醇交替洗滌；優(yōu)選為采用去離子水和乙醇交替洗滌3次以上。

38、步驟③中所述的干燥的方式為：60±5℃烘干10～15?h；優(yōu)選為60℃烘干12?h。

39、步驟④中所述的戊二醛（gda）溶液的濃度為體積百分比2～3%；優(yōu)選為體積百分比2.5%。

40、步驟④中所述的戊二醛（gda）溶液的用量按每克竹粉磁性生物炭（或氨基改性后的竹粉磁性生物炭）配比20～40?ml戊二醛溶液計算；優(yōu)選為按每克竹粉磁性生物炭（或氨基改性后的竹粉磁性生物炭）配比30?ml戊二醛溶液計算。

41、步驟④中所述的反應(yīng)的條件為：20～30℃攪拌反應(yīng)1～3小時；優(yōu)選為25℃攪拌反應(yīng)2小時。

42、步驟④中所述的洗滌為采用離子水進(jìn)行洗滌；優(yōu)選為采用離子水洗滌3次以上。

43、步驟⑤中所述的纖維素酶溶液通過如下方法制備得到：將纖維素酶溶解到ph5.0、0.1?m乙酸-乙酸鈉緩沖液（稱取0.8203g乙酸鈉定容到100ml）中，即得。

44、步驟⑤中所述的纖維素酶溶液的濃度為6～10?mg/ml；

45、步驟⑤中所述的反應(yīng)的條件為：20～30℃攪拌反應(yīng)1～3小時；優(yōu)選為：25℃攪拌反應(yīng)2小時。

46、步驟⑤中所述的洗滌為采用醋酸緩沖液（0.05?mol/l，ph?=?5）進(jìn)行洗滌。

47、一種磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物，通過上述任一項所述的方法制備得到。

48、所述的磁性生物炭負(fù)載纖維素酶復(fù)合物在水解纖維素（產(chǎn)生葡萄糖）中的應(yīng)用。

49、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

50、1、本發(fā)明所提供的磁性生物炭負(fù)載纖維素酶的制備方法簡單，以鐵鹽六水合氯化鐵（fecl3·6h2o）以及四水合氯化亞鐵（fecl2·4h2o）為磁性介質(zhì)，創(chuàng)新性地提出來了“共價沉淀法”制備磁性生物炭。

51、2、本發(fā)明將磁性生物炭引入酶負(fù)載技術(shù)領(lǐng)域，利用價格較低、產(chǎn)量較高的毛竹粉作為原料，降低了生物炭及磁性碳的制備成本，實現(xiàn)了低成本物質(zhì)的資源化利用。

52、3、本發(fā)明利用化學(xué)交聯(lián)法進(jìn)行纖維素酶的負(fù)載，將纖維素酶負(fù)載于該磁性生物炭表面，使二者緊密結(jié)合，其利用戊二醛大幅提升了纖維素酶的有效固定量，一定程度上提高了負(fù)載纖維素酶對纖維素的水解效率，對酶的催化活性和操作穩(wěn)定性具有極大的改善和提升，直觀地展示了相比于游離酶而言，固定化酶在催化反應(yīng)中所具有的優(yōu)勢。

53、4、本發(fā)明采用koh活化的方法，提高生物炭bc的比表面積。經(jīng)粉碎—酮醇抽提—水熱預(yù)處理—koh活化—碳化的方法，制的具有較高比表面積的毛竹生物炭材料（bc）和桉樹生物炭材料（ec），并測定其bet比表面積。經(jīng)koh活化后，毛竹生物炭比表面積由78?m2/g-1提升到521?m2/g-1。

54、5、本發(fā)明中制備的毛竹磁性生物炭對纖維素酶復(fù)合物的負(fù)載能力強，并且可以回收，其具有高效催化活性，可用于水解纖維素產(chǎn)生葡萄糖，降低纖維素的水解成本，提高對纖維素的利用，進(jìn)而實現(xiàn)生物質(zhì)的高值利用。