本發(fā)明涉及基因藥物領域，具體涉及一種sirna篩選方法、熒光報告系統(tǒng)及其應用。

背景技術：

1、sirna藥物是指一種由雙鏈sirna誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，主要在基因水平上發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，是基因治療領域的重要品類，因無需識別蛋白質(zhì)的復雜空間構象，避免鑒定具有高活性、親和力和特異性靶分子的過程，突破許多疾病無法用小分子和抗體藥物治療的創(chuàng)新藥困境。在全球范圍內(nèi)有多款sirna藥物進入臨床或上市，已成為創(chuàng)新藥發(fā)展的快車道。sirna藥物的開發(fā)難點只要集中在3個方面：(1)sirna設計；(2)sirna篩選；(3)sirna遞送系統(tǒng)。

2、sirna篩選的方法目前主要有以下三種方式：

3、(1)qpcr檢測，此方法是將sirna轉染進高表達目的基因的細胞，轉染48h或72h后，收獲細胞，提取rna，反轉錄cdna，再以引物進行qpcr檢測，該方法實驗周期長，檢測效率低，而且采用不同引物的qpcr結果一致性很差。

4、(2)wb檢測，此方法同樣將sirna轉染進高表達目的基因的細胞，轉染48h或72h后，收獲細胞，提取總蛋白，進行wb檢測，該方法同樣實驗周期長，檢測效率低，檢測效果受限制于抗體的特異性。

5、(3)雙熒光報告基因的psicheck-2質(zhì)粒篩選系統(tǒng)，系統(tǒng)含有兩個熒光素酶報告基因，其中主報告基因是海腎報告基因，目的基因串聯(lián)在海腎報告基因的下游，用于檢測sirna的沉默效率，輔報告基因為螢火蟲報告基因，用于檢測細胞狀態(tài)。此方法是將sirna和psicheck-2質(zhì)粒共同孵育，轉染293t細胞，通過添加兩種報告基因底物，在酶標儀上檢測化學發(fā)光值計算sirna的沉默效率，該方法雖然效率高，但其缺點是轉染時需要同時轉染sirna和psicheck-2質(zhì)粒，檢測時需要添加兩種發(fā)光底物，增加實驗操作和檢測成本。

6、因此，開發(fā)出更快捷簡單的sirna篩選方法對sirna藥物的開發(fā)具有重要價值。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種相比現(xiàn)有的sirna篩選方法更快捷、操作更簡單、檢測費用更低的方法，可實現(xiàn)快速、大規(guī)模批量篩選sirna的沉默效率。

2、本發(fā)明的第一方面提供了一種sirna篩選方法，該方法包括：構建帶有熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株，將待篩選的sirna轉染進入所述穩(wěn)定細胞株細胞，通過熒光強度檢測所述sirna的沉默效率，即檢測sirna對目的基因的沉默效率。

3、在本發(fā)明的具體實施方式中，構建帶有熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株具體可采用將目的基因的cdna串聯(lián)插入到慢病毒載體(plv)上的熒光報告基因的下游，再通過慢病毒載體介導構建穩(wěn)定細胞株。

4、本發(fā)明的第二方面提供了一種適用于上述sirna篩選方法的熒光報告系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括慢病毒載體以及用于慢病毒包裝的輔助包裝系統(tǒng)，上述慢病毒載體中目的基因的cdna串聯(lián)插入到熒光報告基因的下游。

5、在本發(fā)明的具體實施方式中，上述熒光報告系統(tǒng)還包括陽性/陰性對照sirna。

6、本發(fā)明的第三方面提供了一種sirna篩選試劑盒，該試劑盒包括慢病毒載體、用于慢病毒包裝的輔助包裝系統(tǒng)和陽性/陰性對照sirna。具體的，上述慢病毒載體包括plv-rluc質(zhì)?；騪lv-fluc質(zhì)粒中的至少一種。該plv-rluc質(zhì)粒，用于表達海腎熒光素酶，結構為：啟動子+t7?promoter+5′utr+海腎熒光素酶+cds克隆位點+3′utr序列+polya。該plv-fluc質(zhì)粒，用于表達螢火蟲熒光素酶，結構為：啟動子+t7?promoter+5′utr+螢火蟲熒光素酶+cds克隆位點+3′utr序列+polya。上述cds克隆位點用于插入目的基因x的cdna。該試劑盒中的陽性對照sirna包括pc?rluc-sirna或pc?fluc-sirna，其中，pc?rluc-sirna的核苷酸序列如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示，pc?fluc-sirna的核苷酸序列如seq?idno.19和seq?id?no.20所示。陰性對照sirna的核苷酸序列如seq?id?no.21和seq?id?no.22所示。

7、作為優(yōu)選，上述試劑盒中啟動子包括sv40啟動子、cmv啟動子、ef1α啟動子、cba啟動子、efs啟動子、sffv啟動子、mscv啟動子或pgk啟動子中的任一種。plv-rluc質(zhì)粒或plv-fluc質(zhì)粒中的5′utr序列包括5′utr1、5′utr2、5′utr3、5′utr4、5′utr5、5′utr6、5′utr7或5′utr8中的任一種。plv-rluc質(zhì)?；騪lv-fluc質(zhì)粒中3′utr序列包括3′utr1、3′utr2、3′utr3、3′utr4、3′utr5、3′utr6、3′utr7或3′utr8中的任一種。

8、在本發(fā)明的一種具體實施方式中提供了一種用于nox1基因的sirna篩選試劑盒，該試劑盒中plv-rluc質(zhì)?；騪lv-fluc質(zhì)粒中的基因x為nox1基因，5′utr序列為5′utr1，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示，3′utr序列為3′utr1，其核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

9、本發(fā)明利用帶有一種熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株，只需單獨轉染sirna進穩(wěn)定細胞株細胞，便可以通過熒光強度檢測sirna沉默效率。與qpcr和wb檢測方法相比，本發(fā)明檢測效率高，耗時時間短；與psicheck-2雙熒光報告系統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明實驗操作更簡單，只需轉染sirna即可，無需轉染質(zhì)粒，減少操作步驟，可以減少每次質(zhì)粒轉染效率帶來的不確定性，檢測時需要添加一種底物即可，節(jié)約時間和實驗成本。

技術特征：

1.一種sirna篩選方法，其特征在于，包括：構建帶有熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株，將待篩選的sirna轉染進入所述穩(wěn)定細胞株細胞，通過熒光強度檢測所述sirna的沉默效率。

2.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述構建帶有熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株，包括：采用將目的基因的cdna串聯(lián)插入到慢病毒載體上的熒光報告基因的下游，再通過慢病毒載體介導構建穩(wěn)定細胞株。

3.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述熒光報告基因包括熒光素酶基因。

4.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述穩(wěn)定細胞株采用人胚胎腎細胞293作為宿主細胞；

5.如權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述慢病毒載體包括plv-rluc質(zhì)?；騪lv-fluc質(zhì)粒中的至少一種，其中：

6.一種用于如權利要求1所述的篩選方法的熒光報告系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光報告系統(tǒng)包括慢病毒載體和用于慢病毒包裝的輔助包裝系統(tǒng)，所述慢病毒載體中目的基因的cdna串聯(lián)插入到熒光報告基因的下游。

7.如權利要求6中所述的熒光報告系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括陽性/陰性對照sirna；

8.如權利要求6中所述的熒光報告系統(tǒng)，其特征在于，所述慢病毒載體包括plv-rluc質(zhì)?；騪lv-fluc質(zhì)粒中的至少一種；

9.如權利要求1-5中任一項所述的篩選方法或如權利要求6-9中任一項所述的熒光報告系統(tǒng)在sirna篩選領域的應用。

10.一種sirna篩選試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括慢病毒載體、用于慢病毒包裝的輔助包裝系統(tǒng)和陽性/陰性對照sirna；所述慢病毒載體包括plv-rluc質(zhì)粒或plv-fluc質(zhì)粒中的至少一種；

技術總結
本申請公開了一種siRNA篩選方法、熒光報告系統(tǒng)及其應用。具體的，本申請公開的siRNA篩選方法包括：構建帶有熒光報告基因和目的基因的穩(wěn)定細胞株，將待篩選的siRNA轉染進入所述穩(wěn)定細胞株細胞，通過熒光強度檢測所述siRNA的沉默效率。利用本申請中的穩(wěn)定細胞株只需單獨轉染siRNA進穩(wěn)定細胞株細胞，便可以通過熒光強度檢測siRNA沉默效率。本申請的siRNA篩選方法快捷、操作簡單、檢測費用低，可實現(xiàn)快速、大規(guī)模批量篩選siRNA的沉默效率。

技術研發(fā)人員：姜孝明,李勇,張培發(fā),胡美齡
受保護的技術使用者：深圳市樂土生物醫(yī)藥有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23