本發(fā)明屬于indel分子標(biāo)記的，涉及一種輔助鑒定高粱抗旱性的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、高粱(sorghumbicolor(l.)moench)是禾本科一年生草本植物，通常生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶和溫帶的干旱半干旱地區(qū)。全球主要糧食作物中，種植面積排名第五，僅次于水稻、玉米、小麥和大豆。高粱作為我國(guó)主要的特色作物之一，在農(nóng)業(yè)上具有多種用途，可用于釀酒、食用、飼料和制作掃帚等。此外，高粱還具有較強(qiáng)的抗逆性，表現(xiàn)在對(duì)干旱、澇水、鹽堿地、貧瘠土壤和高溫等惡劣環(huán)境均具有一定的/較強(qiáng)的適應(yīng)能力。

2、干旱是一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見且嚴(yán)重的非生物脅迫，其特點(diǎn)包括發(fā)生頻率高、范圍廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等。目前，全球超過(guò)三分之一的陸地面積處于干旱和半干旱地區(qū)。在中國(guó)，干旱、半干旱和亞濕潤(rùn)干旱區(qū)的總面積接近300萬(wàn)平方公里，占據(jù)了國(guó)土總面積近四成。干旱脅迫是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，據(jù)估算，每年導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的情況中，有大概60％是由于干旱造成的。因此，研究高粱抗旱性至關(guān)重要。本項(xiàng)目的開展具有重要意義。

3、近年來(lái)，人們對(duì)高粱的抗旱性進(jìn)行了廣泛的研究，研究發(fā)現(xiàn)不同高粱品種的抗旱能力顯著不同?，F(xiàn)階段，中國(guó)的高粱抗旱特性研究主要聚焦于其形態(tài)特征識(shí)別及研究手段的研究上。部分學(xué)者致力于探究高粱在種子發(fā)育初期或者農(nóng)田環(huán)境中的抗旱表現(xiàn)及其評(píng)估方式。而在分子方面，dugas等人利用滲透壓力來(lái)影響高粱生長(zhǎng)并對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以此揭示高粱的抗旱機(jī)理并且找出相應(yīng)的基因。zhang等人使用了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，分別針對(duì)干旱條件下高粱的葉片和根部進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，從而挑選出了許多顯著變化的基因，接著通過(guò)富集(go)分析明確了一些與抗旱能力有關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子。王志恒等人利用peg-6000對(duì)甜高粱進(jìn)行了干旱脅迫，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的兩個(gè)代謝通路，這表明甜高粱通過(guò)激活與干旱脅迫相關(guān)的蛋白表達(dá)和與碳水化合物相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。abdelghany等人針對(duì)高粱的耐旱性進(jìn)行了研究，他們選擇了4種不同的高粱材料，對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，研究發(fā)現(xiàn)，在抗旱基因型中，約有180個(gè)基因在抗旱脅迫下受到差異調(diào)控，大多數(shù)(超過(guò)70％)在抗旱時(shí)上調(diào)。其中約70個(gè)基因的功能是未知的。fracasso等人對(duì)高粱的耐旱性進(jìn)行了研究，他們選取了具有較強(qiáng)抗旱能力的品種is22330與易受到干旱影響的品種is20351，并通過(guò)觀察它們?cè)诟稍锃h(huán)境下的光合反應(yīng)、水汽散失及水分使用效益方面的基因表現(xiàn)來(lái)深入了解其差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)面臨干旱壓力時(shí)，抗旱型的基因表達(dá)量普遍上升，反之，對(duì)于容易遭受干旱傷害的類型來(lái)說(shuō)，它們的基因表達(dá)卻呈下降趨勢(shì)，由此確定了三個(gè)基因作為評(píng)估高粱耐旱性的重要候選基因。

4、目前，高粱抗旱性的研究主要集中在生理學(xué)層面，比如干旱脅迫后生理生化指標(biāo)的變化，多局限于單一組學(xué)層面的探索，如基因組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)，而對(duì)不同組學(xué)數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析較少，缺乏對(duì)其分子機(jī)制的深入探究。因此在揭示高粱抗旱機(jī)制上仍存在諸多不足。目前仍沒有關(guān)于高粱抗旱性狀與分子標(biāo)記的相關(guān)研究，因此，開發(fā)高粱抗旱性分子標(biāo)記，對(duì)高粱抗旱輔助育種具有重要的實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提供一種輔助鑒定高粱抗旱性的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案：

3、一種輔助鑒定高粱抗旱性的indel分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的上游引物序列為f:gacatgtcttaatcgcacgtac，下游引物序列為r:ggtttttgcggctgataaagtg；

4、所述高粱抗旱性的indel分子標(biāo)記用于高粱抗旱性狀的鑒定，出現(xiàn)304bp帶型表示材料抗旱性強(qiáng)，條帶位置靠下(條帶大)是不抗旱的。

5、用于擴(kuò)增高粱indel分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)為上游引物序列f:gacatgtcttaatcgcacgtac，下游引物序列r:ggtttttgcggctgataaagtg。

6、一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，包括以下步驟：

7、(1)以所述高粱樣品dna為模板，用選自權(quán)利要求1中的引物對(duì)擴(kuò)增indel分子標(biāo)記；

8、(2)電泳圖譜分析，根據(jù)樣本的聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)帶型進(jìn)行判讀，出現(xiàn)304bp帶型表示材料抗旱性強(qiáng)。

9、進(jìn)一步地，所述的擴(kuò)增為pcr擴(kuò)增：

10、反應(yīng)體系包括：2×taqpcr?mastermix?5μl，10μm上游引物0.5μl，10μm下游引物0.5μl，dna模板0.5μl，ddh2o?3.5μl；

11、反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2min；94℃40s，58℃45s，72℃1min?30s循環(huán)26次；72℃7min。

12、進(jìn)一步地，所述聚丙烯酰胺凝膠為非變性聚丙烯酰胺凝膠，配方如下：

13、30％制膠液15ml，5×tbe電泳緩沖液10ml，h2o?25ml，10％ap600μl，temd?40μl。

14、進(jìn)一步地，電泳條件為120v，400ma，30min，180v，400ma，1h15min。

15、進(jìn)一步地，電泳結(jié)束后取出膠，用槍尖進(jìn)行打孔標(biāo)記，agno3溶液銀染10-15min；顯色液顯色5-8min；水漂洗2次后置于燈箱上拍照，得到結(jié)果。

16、如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的檢測(cè)試劑在輔助鑒定高粱抗旱性品種選育中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明有益效果：

18、本發(fā)明的indel分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確地鑒定高粱的抗旱性狀，可以顯著提高高粱抗旱育種的選擇效率，從而加快育種進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)高粱抗旱性的定向遺傳改良。

技術(shù)特征：

1.一種輔助鑒定高粱抗旱性的indel分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記的上游引物序列為f:gacatgtcttaatcgcacgtac，下游引物序列為r:ggtttttgcggctgataaagtg；

2.用于擴(kuò)增高粱indel分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)為上游引物序列f:gacatgtcttaatcgcacgtac，下游引物序列r:ggtttttgcggctgataaagtg。

3.一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增為pcr擴(kuò)增：

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝膠為非變性聚丙烯酰胺凝膠，配方如下：

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，其特征在于，電泳條件為120v，400ma，30min，180v，400ma，1h15min。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定高粱抗旱性的方法，其特征在于，電泳結(jié)束后取出膠，用槍尖進(jìn)行打孔標(biāo)記，agno3溶液銀染10-15min；顯色液顯色5-8min；水漂洗2次后置于燈箱上拍照，得到結(jié)果。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的檢測(cè)試劑在輔助鑒定高粱抗旱性品種選育中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定高粱抗旱性的InDel分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于InDel分子標(biāo)記的技術(shù)領(lǐng)域，所述分子標(biāo)記的上游引物序列為F:GACATGTCTTAATCGCACGTAC，下游引物序列為R:GGTTTTTGCGGCTGATAAAGTG；所述高粱抗旱性的InDel分子標(biāo)記用于高粱抗旱性狀的鑒定，出現(xiàn)304bp帶型表示材料抗旱性強(qiáng)。本發(fā)明的InDel分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確地鑒定高粱的抗旱性狀，可以顯著提高高粱抗旱育種的選擇效率，從而加快育種進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)高粱抗旱性的定向遺傳改良。

技術(shù)研發(fā)人員：焦志銀,呂芃,石燕楠,王金萍,王志芳,果永超,孫安棟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2