本發(fā)明涉及小麥遺傳學(xué)及其分子育種，具體涉及一種快速鑒定粗山羊草中白粉病抗性的kasp標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥白粉病菌是由禾谷藍(lán)霉（ blumeriagraminis?f. sp.）引起的子囊菌亞門布氏白粉菌屬真菌，是一種破壞性疾病，嚴(yán)重威脅小麥的產(chǎn)量和食品安全。近年來(lái)，隨著氣候的變化，在我國(guó)主要麥區(qū)，如西南、西北、華北、東北麥區(qū)，均有發(fā)病日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。因此，防治小麥白粉病對(duì)改善小麥品質(zhì)、提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。而鑒定抗性基因是開(kāi)發(fā)抗病品種和控制該病的最環(huán)保、有效的策略。

2、迄今為止，小麥及其近緣野生種質(zhì)中已鑒定超110個(gè)pm基因，克隆了18個(gè)。雖已將部分近緣種屬的抗病基因如 pm2b、 pm4、 pm50等導(dǎo)入小麥。但連鎖的有害性狀和雜種劣勢(shì)會(huì)降低產(chǎn)量和品質(zhì)，如 pm16導(dǎo)致15%產(chǎn)量損失。此外，現(xiàn)有pm基因如 pm1至 pm5和 pm8等正逐漸失去對(duì) bgt分離株的抗性，即使是最有效的基因 pm21，也面臨著強(qiáng)大的選擇壓力和失去抗性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找能平衡廣譜抗性和農(nóng)藝性狀的新型抗白粉病基因是提升小麥高產(chǎn)多抗的關(guān)鍵。

3、粗山羊草（ aegilopstauschii,?2n=14,?dd），是異源六倍體小麥d基因組的供體，其蘊(yùn)含著豐富的抗性基因，并且有容易轉(zhuǎn)移到小麥中利用的特點(diǎn)。

4、分子標(biāo)記作為一種簡(jiǎn)單、低成本的技術(shù)，在小麥與其近緣種遠(yuǎn)緣雜交材料的分子鑒定中也起著至關(guān)重要的作用。若想實(shí)現(xiàn)多抗病基因高效聚合，同時(shí)優(yōu)化農(nóng)藝性狀的目標(biāo)，可直接通過(guò)分子輔助選擇將功能互補(bǔ)的多基因聚合，在不犧牲其他農(nóng)藝性狀的前提下增強(qiáng)小麥廣譜持久抗性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本專利提供了一種快速鑒定粗山羊草中白粉病抗性的kasp標(biāo)記及其應(yīng)用。

2、粗山羊草ku-2013經(jīng)過(guò)白粉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)其是小麥白粉病持久免疫的抗源。小麥白粉病抗病性鑒定及遺傳分析表明，?ku-2013的2d染色體上攜帶一個(gè)單顯性抗病基因，暫時(shí)將其命名為 pmku-2013。

3、本發(fā)明提供了一套針對(duì)小麥白粉病抗性的分子標(biāo)記體系及應(yīng)用策略，以期填補(bǔ)當(dāng)前育種技術(shù)中在利用高效分子標(biāo)記輔助選育小麥白粉病抗性品種方面的空白。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

4、發(fā)明人在對(duì)dhku-2013(粗山羊草ku-2013與硬粒小麥langdon雜交的人工合成六倍體小麥)抗白粉病基因進(jìn)行初步定位在其2d染色體5.9m的基礎(chǔ)上（圖1），在定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)了一組親本間抗、感多態(tài)性kasp標(biāo)記。利用該標(biāo)記，對(duì)隨機(jī)挑選的、來(lái)自國(guó)內(nèi)各地的40份常用于小麥育種的品種和硬粒小麥langdon進(jìn)行了基因型分析。分析結(jié)果顯示，這40份小麥品種的基因型均和硬粒小麥langdon都與感病對(duì)照dh2147(粗山羊草2147與硬粒小麥langdon雜交的人工合成六倍體小麥)的基因型相吻合。這一發(fā)現(xiàn)表明，所設(shè)計(jì)的kasp標(biāo)記在 pmku-2013基因向小麥育種轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，具有潛在的分子輔助選擇作用。所述kasp標(biāo)記名稱為 sdau-kasppm2013，其引物組核苷酸序列分別為：

5、fam（seq?id?no:1）：

6、gaaggtgaccaagttcatgctcgaagctggtgaaaaatgatcgcc（感病位點(diǎn)結(jié)合）；

7、hex（seq?id?no:2）：

8、gaaggtcggagtcaacggattccgaagctggtgaaaaatgatcgct（抗病位點(diǎn)結(jié)合）；

9、com（seq?id?no:3）：

10、caccccagtctcagtttctgctaa。

11、利用粗山羊草抗白粉病基因 pmku-2013的連鎖標(biāo)記 sdau-kasppm2013，其使用方法分別如下：

12、（1）以小麥或粗山羊草dna為pcr擴(kuò)增模板，以sdau-kasppm2013為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系約為5μl。上述反應(yīng)體系具體包括：80ng/μl的dna?1μl，2×kasp?mix?2.5μl，kasp?primer?mix?0.35μl，ddh2o補(bǔ)至5μl.

13、（2）pcr擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性15min；94℃變性20s，65退火和延伸1min（每循環(huán)降低0.8℃），10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，57℃復(fù)性1min，28個(gè)循環(huán)；

14、（3）pcr結(jié)束后，置于384孔多熒光通道定量?pcr?儀上進(jìn)行熒光讀取以及檢測(cè)pcr分型結(jié)果；

15、（4）分析鑒定，分型若集中在y軸，則屬于抗病基因型，分型若集中在x軸，則屬于感病基因型，位于原點(diǎn)的分型則表示為陰性對(duì)照。

16、本研究與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

17、本發(fā)明獲得pmku-2013的連鎖kasp標(biāo)記：sdau-kasppm2013；sdau-kasppm2013屬于kasp標(biāo)記，具有高通量、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可以用于大規(guī)模分離群體的高通量篩選，對(duì)pmku2013進(jìn)行精細(xì)定位；sdau-kasppm2013檢測(cè)隨機(jī)選取的40份小麥品種均為感病基因型，因此在小麥育種中可作為pmku2013抗性輔助選擇的分子標(biāo)記。

技術(shù)特征：

1.一種快速鑒定粗山羊草中白粉病抗性的kasp標(biāo)記，所述的標(biāo)記為sdau-kasppm2013，其特征在于：用于擴(kuò)增所述的標(biāo)記sdau-kasppm2013的引物組合及其對(duì)應(yīng)的引物序列如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記在精細(xì)定位基因并克隆pmku-2013的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記在鑒定粗山羊草種質(zhì)中抗白粉病基因pmku-2013的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的標(biāo)記，在篩選將粗山羊草的抗白粉病基因pmku-2013轉(zhuǎn)移至小麥分子輔助育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及小麥遺傳學(xué)及其分子育種技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種快速鑒定粗山羊草中白粉病抗性的KASP標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明借助抗白粉病基因PmKu?2013的遺傳定位，結(jié)合小麥D基因組的參考序列，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記SDAU?kaspPm2013，可以用于小麥抗白粉病育種、抗白粉病性狀的早期分子標(biāo)記輔助選擇，可以提高育種效率。

技術(shù)研發(fā)人員：馬信,陳武英,李靜,齊丹丹,梁明敏,孔令讓
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23