本發(fā)明屬于生物活性肽領(lǐng)域，具體涉及一種氨基酸序列為gln-ile-gly-leu-phe(qiglf)的蛋清源活性肽的超分子自組裝體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、受到天然蛋白質(zhì)以及肽結(jié)構(gòu)和諧和功能之美的啟發(fā)，研究人員追求自然界的無上智慧，模擬制造復(fù)雜且高度有序的超結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生具有多種功能的新型生物材料。食品蛋白質(zhì)降解后釋放的肽不僅是構(gòu)建和修復(fù)生物體的基礎(chǔ)材料，承擔(dān)著人類生長及受損細胞的修復(fù)和更新任務(wù)，還為獲取自組裝肽構(gòu)建模塊以組織高階結(jié)構(gòu)提供了重要的寶藏。雖然一些具有明確結(jié)構(gòu)特征的食品衍生肽能夠基于非共價相互作用自組裝形成多樣化的精細結(jié)構(gòu)，但借助共價化學(xué)的自組裝是幫助缺乏二級結(jié)構(gòu)(如β-折疊)、內(nèi)在無序或兩親特性的食品衍生肽開發(fā)具有微妙架構(gòu)、動態(tài)相互作用和多功能性的超結(jié)構(gòu)以執(zhí)行生物功能的重要途徑。目前，一系列具有可逆共價鍵合特征的動態(tài)反應(yīng)已成功用于設(shè)計功能材料、自下而上的組裝過程和分子機器。

2、席夫堿鍵(亞胺鍵-n＝ch-)是由醛(或酮)基團與氨基之間形成的動態(tài)共價鍵，它能夠與非共價相互作用協(xié)同調(diào)節(jié)組裝體的結(jié)構(gòu)和功能。該鍵賦予組裝體自發(fā)熒光特性，有助于在體內(nèi)進行生物追蹤，無需外部熒光染料。更重要的是，動態(tài)共價作用的調(diào)控使組裝體具備獨特的適應(yīng)性、動態(tài)特性和在生物系統(tǒng)中相對穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)。這種席夫堿誘導(dǎo)的動態(tài)共價組裝已成為構(gòu)建肽基納米載體以封裝遞送食藥成分強大而有效的策略。它還為解決疏水組分囿于極低水溶性而導(dǎo)致的生物利用度有限問題提供了新思路。

3、然而，超分子納米遞送載體的實際應(yīng)用仍然面臨諸多的挑戰(zhàn)，尤其是在疏水性化合物包封方面尤為突出。一個顯著的問題是難以有效提高包封能力，通常包封率低于10％。此外，組裝體穿透腸上皮細胞進入血液循環(huán)的效率極低，顯著限制了其中所加載功效成分到達目標(biāo)部位的數(shù)量及其隨后發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能的能力。因此，迫切需要構(gòu)建具有優(yōu)異包封能力和有效克服腸道吸收屏障的優(yōu)質(zhì)納米載體。基于席夫堿動態(tài)共價鍵賦予食源性生物活性肽超分子結(jié)構(gòu)，從而設(shè)計出具有高效藥物包封能力、高生物相容性以及有效穿透腸上皮吸收屏障的疏水性遞送載體具有重要的意義和前景。

4、本發(fā)明旨在提供一種席夫堿動態(tài)共價鍵介導(dǎo)的肽基超分子自組裝體，可用于強力效封裝疏水性姜黃素并提升其生物可及性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了一種以gln-ile-gly-leu-phe為氨基酸序列基礎(chǔ)，由席夫堿動態(tài)共價鍵介導(dǎo)的一組混合構(gòu)建模塊組裝而成的肽基超分子自組裝體(qiglf-ga?sa)，該自組裝體可用于疏水組分姜黃素(curcumin,cur)的高效封裝、抗氧化活性及生物可及性增益。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案為：

3、步驟一、肽自組裝體構(gòu)建及鑒定

4、1.0～4.0mg/ml的qiglf溶解于超純水中，持續(xù)磁力攪拌下加入1.0～3.0％(v/v)的戊二醛(ga，50％)溶液。調(diào)節(jié)體系ph為5.0～7.0，30～45℃水浴反應(yīng)18～36h。反應(yīng)完成后將體系經(jīng)3.5kda的透析袋透析24～36h，透析液為水，期間等間隔更換2次透析液，去除未參與反應(yīng)的ga。此后將反應(yīng)體系冷凍干燥即可得到本發(fā)明報道的肽自組裝體。此后將自組裝體以水為溶劑，α-氰基-4-羥基肉桂酸(chca)作為基質(zhì)進行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)測量，測試分子量范圍1000-10000da，正離子檢測。

5、所述調(diào)節(jié)溶液ph的試劑優(yōu)選為naoh，更優(yōu)選為1.0m?naoh；所述水優(yōu)選為去離子水；所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為37℃，反應(yīng)時間優(yōu)選為24h。所述混合構(gòu)建模塊經(jīng)maldi-tof-ms法鑒定，包括2qiglf-3ga(分子式：c71h104n12o16)、2qiglf-2ga、2qiglf-4ga、2qiglf-5ga，四者的含量比約為11∶3∶6∶2。

6、步驟二、離心法測定ph驅(qū)動下自組裝體對疏水性姜黃素的封裝能力

7、自組裝體的水溶液(0.25～1.0mg/ml)與等體積的姜黃素溶液(0.1mg/ml，預(yù)先在ph＝12.0的水中溶解)混合，隨后用naoh溶液調(diào)節(jié)混合液的ph至12.0，并持續(xù)攪拌。隨后，迅速用hcl溶液將體系的ph調(diào)節(jié)至7.0，以獲得裝載姜黃素的超分子共組裝體。此后樣品經(jīng)過離心去除未被包封的姜黃素后，通過紫外分光光度計在425nm處建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(r2>0.999)的方法定量上清液中姜黃素的濃度，根據(jù)公式(1)計算自組裝體對姜黃素的封裝能力(encapsulation?capacity,ec)。

8、

9、所述調(diào)節(jié)ph的naoh優(yōu)選為6m，hcl優(yōu)選為1m；樣品的離心條件為8000～12000rpm/min，10min，優(yōu)選為10000rpm/min，10min。

10、步驟三：dpph、abts測定抗氧化活性增益

11、(1)dpph自由基清除活性：先用75％乙醇配制0.2mm的dpph溶液，適當(dāng)稀釋使其在517nm除的紫外吸收為0.8±0.02。待測樣品配置好后于暗處反應(yīng)1.5～2h，反應(yīng)結(jié)束后于將樣品離心取上清，此后將樣品(姜黃素濃度10ug/ml)與dpph溶液體積比1∶2混合后暗處孵育0.5h。dpph與純水混合作對照，反應(yīng)結(jié)束后用紫外分光光度計測定樣品在517nm處的吸光度值。dpph自由基清除活性計算公式如下:

12、

13、式中，ac和as分別為對照組和實驗組的吸光度值。

14、所述離心條件為4℃、9000～12000r/min，5～15min，優(yōu)選為10000r/min，10min。

15、(2)abts自由基清除活性：將濃度分別為7mm的abts試劑和2.45mm的過硫酸鉀按照1∶1的體積混合，室溫下避光孵育12～16h，使用前用pbs緩沖液進行稀釋，使其在734nm處的吸光度值為0.70±0.02，得到abts工作液。在96孔板中每孔加入20μl樣品(姜黃素濃度10μg/ml)，再加入180μlabts工作液，震蕩10s后室溫靜置5～10min，用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)體系在734nm處的吸光度值。abts自由基清除活性計算公式為：

16、

17、式中，ac、as和ab別為對照組、實驗組和空白組的吸光度值。

18、步驟四：mts法測定細胞毒性及溶血實驗評價生物相容性

19、(1)mts法測定細胞毒性：將caco-2或l02細胞接種于96孔板中(90μl)，培養(yǎng)12～16h后，每孔加入10μl的樣品繼續(xù)孵育24～36h，加入20μlmts并處理2～4h。使用酶標(biāo)儀記錄490nm處的吸光值?？瞻捉M使用90μl?dmem代替細胞懸液，對照組使用10μl?dmem代替樣品。細胞活力按照公式(4)計算：

20、

21、其中，as、ab和ac分別代表樣品組、空白組和對照組的吸光值。

22、(2)溶血實驗：新鮮無菌去纖維化兔血用生理鹽水多次洗滌后，稀釋得到4％的紅細胞懸液。將適量的樣品與等體積的紅細胞懸液混合，在37℃下震蕩3～6h。超純水和生理鹽水分別作為陽性和陰性對照組。孵育結(jié)束后離心樣品。使用酶標(biāo)儀檢測上清液在540nm處的吸光值，并用公式(5)計算溶血率：

23、

24、其中，as、ab和ac分別代表樣品、陰性對照組和陽性對照組的吸光值。

25、所述樣品離心條件為2000～4000r/min，10min，優(yōu)選為3000r/min，10min。

26、步驟五：caco-2細胞單層膜轉(zhuǎn)運評估實驗生物可及性增益

27、將caco-2細胞接種于12孔transwell板中，連續(xù)培養(yǎng)21天以上直至跨膜電阻(teer)值達到400～600ω/cm2。將不同樣品以相同的姜黃素含量為標(biāo)準(zhǔn)分別加入到單層膜的頂端，孵育2～3h后，從另一側(cè)取樣。使用酶標(biāo)儀定量樣品中的姜黃素含量后，按照公式(6)計算表觀滲透系數(shù)(papp)。

28、

29、其中，q是滲透的樣品總量(μg)，a是膜面積(cm2)，c是供體區(qū)樣品的初始濃度(μg/ml)，t是實驗的總時間(s)。

30、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

31、(1)本發(fā)明基于席夫堿動態(tài)共價鍵介導(dǎo)食源性肽的自組裝，所報道的自組裝體具有高度的生物相容性。

32、(2)本發(fā)明顯著提高了姜黃素的封裝能力(>22％)，遠高于當(dāng)前納米載體荷載率普遍低于10％的現(xiàn)實水平，

33、(3)本發(fā)明顯著增益了姜黃素的抗氧化活性，自組裝體封裝姜黃素后dpph、abts自由基清除活性分別可達35.4％和19.4％以上，分別約為相同實驗條件下游離姜黃素的11.8倍和2.6倍。

34、(4)自組裝體封裝100μg/ml的姜黃素后(對應(yīng)自組裝體濃度為250μg/ml)，細胞毒性實驗的結(jié)果為：caco-2細胞存活率83.4％～88.2％，l02細胞存活率89.2％～91.5％；溶血率為0.414％～0.307％，佐證了自組裝體高度的生物相容性。

35、(5)自組裝體可顯著提升姜黃素的生物可及性，自組裝體封裝姜黃素后可將姜黃素在caco-2細胞單層膜上的表觀滲透系數(shù)paap值提升至3.996×10-7～4.223×10-7cm/s，是相同實驗條件下游離姜黃素的11.23～12.68倍。

36、本發(fā)明報道的超分子自組裝體在疏水組分封裝遞送方面具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景。