(一)本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種能夠提高外源蛋白在植物種子中表達(dá)量的重組啟動子及方法。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、應(yīng)用植物生產(chǎn)重組蛋白是規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白的新方法，當(dāng)前已經(jīng)有親和素(avidin)、胰蛋白酶(trypzean)、漆酶(laccase)、乳鐵蛋白(lacromin)和溶菌酶等多種在植物中生產(chǎn)的重組蛋白實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。植物具有容易擴(kuò)大規(guī)模、產(chǎn)能彈性大、硬件要求低等優(yōu)點，但重組蛋白表達(dá)量往往不如傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵，因此只有提高植物中重組蛋白表達(dá)量，才能夠更大程度發(fā)揮植物生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)勢。

2、種子被認(rèn)為是植物生產(chǎn)和儲存重組蛋白的理想場所，種子具有更高的蛋白生產(chǎn)潛力，而且干燥狀態(tài)下的種子處于代謝惰性狀態(tài)，種子中的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定儲存較長時間。如何提高重組蛋白在種子中的表達(dá)量在推動植物源重組蛋白的商業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。

3、影響種子中蛋白表達(dá)的因素有很多，比如：轉(zhuǎn)錄水平、翻譯效率、重組蛋白修飾和定位等等。為了提高種子中重組蛋白的表達(dá)量，往往需要同時對轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)運和積累等各個方面進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。比如轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化主要是通過篩選高表達(dá)的啟動子，并改變啟動子拷貝數(shù)、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合間距及核心啟動子序列等要素，獲得驅(qū)動目標(biāo)基因高水平轉(zhuǎn)錄的人工啟動子(趙婉彤等，分子植物育種，2019,17(22)：7377-7358)。通過優(yōu)化密碼子提高提高翻譯效率；設(shè)計信號肽或亞細(xì)胞定位序列改善重組蛋白的轉(zhuǎn)運、定位和積累。這一系列的優(yōu)化為種子中重組蛋白的表達(dá)提供更穩(wěn)定的條件，但是種子中蛋白總量相當(dāng)穩(wěn)定，表達(dá)重組蛋白需要和其它貯藏蛋白競爭資源，研究顯示抑制種子中貯藏蛋白合成后，游離氨基酸或氮源會增加，并重新分配用于合成其他蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)種子中蛋白質(zhì)總量的平衡。因此將降低種子中貯藏蛋白表達(dá)與提高重組蛋白表達(dá)設(shè)計相結(jié)合，營造更適宜重組蛋白表達(dá)的環(huán)境，能夠提高重組蛋白表達(dá)量、降低重組蛋白生產(chǎn)成本，提高植物生產(chǎn)重組蛋白的競爭力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種用于提高植物種子中外源蛋白表達(dá)量的重組啟動子及方法，所述重組啟動子在種子中特異性表達(dá)外源蛋白的同時能夠抑制種子貯藏蛋白基因的表達(dá)，實現(xiàn)外源蛋白在種子中高水平表達(dá)和積累。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種用于提高外源基因在植物種子中表達(dá)水平的重組啟動子，所述重組啟動子由啟動外源基因在植物中表達(dá)的啟動子序列和抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核酸序列兩部分功能性連接而成。

4、本發(fā)明所述抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)貯藏蛋白基因核苷酸序列設(shè)計的可以抑制貯藏蛋白基因表達(dá)的重組核苷酸序列。所述抑制貯藏蛋白基因表達(dá)的核苷酸序列連接在啟動子和外源基因之間。

5、進(jìn)一步，所述種子貯藏蛋白包括玉米19kda和22kda醇溶蛋白，抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

6、進(jìn)一步，啟動子包括種子特異性啟動子及本領(lǐng)域公知的能夠啟動外源基因在植物中表達(dá)的啟動子，比如水稻谷蛋白啟動子，核苷酸序列為seq?id?no：1所示。所述外源蛋白包括各種能夠在植物種子中表達(dá)的蛋白，比如脂肪酶蛋白。

7、本發(fā)明還提供一種所述重組啟動子提高外源基因在種子中表達(dá)水平的方法，所述方法是將含有重組啟動子的外源基因表達(dá)框轉(zhuǎn)入植物基因組，篩選外源蛋白表達(dá)顯著提高的種子。

8、進(jìn)一步，所述外源基因表達(dá)框從5’端到3’端依次由啟動外源基因表達(dá)的啟動子、抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核酸序列、外源基因和終止子功能性連接構(gòu)成。所述外源基因表達(dá)框還可以與篩選標(biāo)記基因表達(dá)框一起轉(zhuǎn)入植物基因組，所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)框采用本領(lǐng)域公知的表達(dá)框即可。

9、本發(fā)明方法適用各種利用植物種子表達(dá)外源蛋白的情況，能夠啟動外源基因表達(dá)以及抑制貯藏蛋白表達(dá)的序列組合均在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明通過將抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的序列添加至啟動子與外源基因之間，對啟動外源基因在植物中表達(dá)的種子特異性啟動子進(jìn)行改造設(shè)計，將結(jié)合了抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)序列的人工合成啟動子構(gòu)建的外源重組蛋白表達(dá)框轉(zhuǎn)入植物基因組中，實現(xiàn)在種子中特異性表達(dá)外源基因的同時抑制種子中貯藏蛋白基因的表達(dá)，營造更適宜外源蛋白表達(dá)和積累的環(huán)境，提高外源蛋白在植物種子中的表達(dá)量，降低植物生產(chǎn)重組蛋白的成本。

技術(shù)特征：

1.一種用于提高植物種子中外源蛋白表達(dá)量的重組啟動子，其特征在于，所述重組啟動子由啟動外源基因在植物中表達(dá)的啟動子序列和抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核酸序列兩部分功能性連接而成。

2.如權(quán)利要求1所述的重組啟動子，其特征在于，所述抑制貯藏蛋白基因表達(dá)的核苷酸序列連接在啟動子和外源基因之間。

3.如權(quán)利要求1所述的重組啟動子，其特征在于，所述種子貯藏蛋白包括玉米19kda和22kda醇溶蛋白。

4.如權(quán)利要求1所述的重組啟動子，其特征在于，抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

5.一種權(quán)利要求1所述重組啟動子提高外源基因在種子中表達(dá)量的方法，其特征在于，所述方法是將含有重組啟動子的外源基因表達(dá)框轉(zhuǎn)入植物基因組，篩選外源蛋白表達(dá)顯著提高的種子。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述外源基因表達(dá)框從5’端到3’端依次由啟動外源基因表達(dá)的啟動子、抑制種子貯藏蛋白基因表達(dá)的核酸序列、外源基因和終止子功能性連接構(gòu)成。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于提高外源基因在植物種子中表達(dá)量的重組啟動子及方法，本發(fā)明通過將抑制種子貯藏蛋白表達(dá)的序列添加至啟動子與外源基因之間，實現(xiàn)在種子中特異性表達(dá)外源重組蛋白的同時抑制種子中貯藏蛋白的表達(dá)，營造更適宜外源蛋白表達(dá)和積累的環(huán)境，提高外源重組蛋白在植物種子中的表達(dá)量，降低植物生產(chǎn)重組蛋白的成本。

技術(shù)研發(fā)人員：林朝陽,何逸洋,佘明君,趙宇,余媛美
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23