本發(fā)明涉及一種模擬結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)快篩模型，屬于體外消化模擬。

背景技術(shù)：

1、結(jié)腸類器官近年來(lái)成為研究腸道發(fā)育、疾病、藥物篩選等領(lǐng)域的重要工具。類器官具有三維結(jié)構(gòu)，能夠在體外模擬腸道內(nèi)的物理和生物環(huán)境，并且在藥物篩選及疾病模型構(gòu)建中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。然而，類器官培養(yǎng)系統(tǒng)需要提供適當(dāng)?shù)难鯕猸h(huán)境，因?yàn)榻Y(jié)腸上皮細(xì)胞依賴氧氣進(jìn)行代謝和維持其功能。而另一方面，腸道菌群，尤其是腸道中的大部分厭氧菌(如擬桿菌和梭菌等)，則在無(wú)氧或低氧環(huán)境下才能保持正常的生長(zhǎng)和代謝。因此，類器官與腸道菌群的共培養(yǎng)面臨一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)，即如何在同一系統(tǒng)中同時(shí)滿足類器官和菌群的不同氧氣需求。

2、現(xiàn)有的類器官與腸道菌群共培養(yǎng)技術(shù)中，類器官和菌群往往分開(kāi)培養(yǎng)，無(wú)法在同一體系內(nèi)精確調(diào)控氧氣梯度。這不僅增加了操作復(fù)雜性，而且限制了對(duì)類器官與菌群真實(shí)相互作用的研究。由于缺乏對(duì)類器官和菌群共存時(shí)不同氧需求的協(xié)調(diào)和調(diào)控，現(xiàn)有系統(tǒng)中菌群容易過(guò)度增殖或類器官功能受損，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差或失效。

3、因此，如何在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)類器官的有氧環(huán)境與腸道菌群的厭氧環(huán)境的有機(jī)結(jié)合，成為這一領(lǐng)域尚未解決的技術(shù)空白點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠快速篩選結(jié)腸類器官與腸道菌群共培養(yǎng)的快篩模型，解決類器官和腸道菌群對(duì)不同氧氣需求的協(xié)調(diào)問(wèn)題?；谠撃Ｐ?，可以在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中同時(shí)滿足類器官的有氧環(huán)境需求和腸道菌群的厭氧生長(zhǎng)條件，實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定的體外共培養(yǎng)環(huán)境。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型，所述模型的制備方法為：

3、(1)使用基質(zhì)膠重懸類器官，鋪于transwell上室中，培養(yǎng)；

4、(2)將甲基纖維素、聚乙二醇二丙烯酸酯、粘蛋白、甲基丙烯酰化明膠、甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?膦氧化物和含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基混合，鋪于步驟(1)的基質(zhì)膠上，固化得到水凝膠層；

5、(3)transwell上室中，步驟(2)的水凝膠層表面加入結(jié)腸酵解液；transwell下室中，加入類器官培養(yǎng)基，得到具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型；

6、其中，人工腸道菌群由prevotella?copri?atcc-33547、faecalibacteriumprausnitzii?atcc-27768、roseburia?faecis?mingzhoubio-b84313、bifidobacteriumlongum?atcc-15707、ruminococcus?bromii?atcc-27255、bifidobacterium?adolescentisatcc-15707、bacteroides?uniformis?atcc-25285、collinsella?aerofaciens?atcc-25986、ruminococcus?gnavus?atcc-29149和akkermansia?muciniphila?atcc-baa-835按照活菌數(shù)(108cfu/ml)比例0.10～0.30：0.10～0.30：0.05～0.20：0.05～0.20：0.05～0.20：0.005～0.1：0.005～0.1：0.01～0.03：0.01～0.03：0.01～0.03組成；

7、含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基由人工腸道菌群接種于腸道培養(yǎng)基得到；

8、結(jié)腸酵解液由人工腸道菌群接種于含有小腸消化物的腸道培養(yǎng)基中，發(fā)酵得到。

9、在一種實(shí)施方式中，含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基和結(jié)腸酵解液中，人工腸道菌群的接種量為8～15％v/v。

10、在一種實(shí)施方式中，transwell小室可通過(guò)市售購(gòu)買得到，規(guī)格包括但不限于6孔板transwell、12孔板transwell、34孔板transwell、96孔板transwell；或是具有transwell結(jié)構(gòu)的容器；上述人工腸道菌群可通過(guò)市售購(gòu)買得到；

11、可選地，transwell小室為12孔板transwell。

12、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)transwell小室的上室中類器官的個(gè)數(shù)為30～40個(gè)。

13、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)培養(yǎng)是在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天。

14、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)中甲基纖維素、聚乙二醇二丙烯酸酯、粘蛋白、甲基丙烯?；髂z、甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?膦氧化物的質(zhì)量比為0.5～1：8～12：0.5～1：0.3～0.8：0.3～0.8：0.3～0.8。

15、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)中水凝膠層的厚度為1.5～2.5mm。

16、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)的水凝膠層中活菌數(shù)為0.1～10×108cfu。

17、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)的結(jié)腸酵解液中活菌數(shù)為0.1～10×109cfu。

18、在一種實(shí)施方式中，以12孔板transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，水凝膠層中活菌數(shù)為1～10×108cfu；結(jié)腸酵解液中活菌數(shù)為1～10×109cfu。

19、在一種實(shí)施方式中，含有小腸消化物的腸道培養(yǎng)基的制備方法為：

20、將樣品和模擬口腔液混合，加入cacl2溶液和水，混勻得到口腔消化物；將口腔消化物和模擬胃液混合，加入cacl2溶液、胃脂肪酶、胃蛋白酶和水，攪拌得到胃消化物；將胃消化物和模擬小腸液混合，加入cacl2溶液、胰蛋白酶、胰脂肪酶、膽鹽和水，攪拌得到小腸消化物；小腸消化物離心，得到未消化固體殘?jiān)托∧c消化液，將8～12％v/v的小腸消化液和未消化固體殘?jiān)D(zhuǎn)移至腸道培養(yǎng)基中，得到含有小腸消化物的腸道培養(yǎng)基；

21、其中，樣品包括淀粉、乳清蛋白、脂肪酸；

22、模擬口腔液由kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o、(nh4)2co3和水配制得到；

23、模擬胃液由nacl、kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o、(nh4)2co3和水配制得到；

24、模擬小腸液由nacl、kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o和水配制得到。

25、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供任一上述的模型在檢測(cè)多糖基食品消化、藥物篩選或構(gòu)建疾病模型中的應(yīng)用。

26、在一種實(shí)施方式中，所述多糖基食品包括谷物類食物、淀粉、抗性淀粉；可選地，淀粉包括但不限于玉米淀粉、乙酰化淀粉、丙?；矸?、丁?；矸邸?/p>

27、在一種實(shí)施方式中，藥物篩選包括腸道吸收的藥物。

28、在一種實(shí)施方式中，疾病模型為腸道疾病模型，包括但不限于炎癥性腸病、腸道感染性疾病、結(jié)直腸癌、腸道纖維化模型、腹瀉模型。

29、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供任一種模擬結(jié)腸消化的方法，將樣品制備為具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型，模擬3～24h；

30、所述具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型的制備方法包括：

31、(1)制備結(jié)腸酵解液和含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基

32、將樣品和模擬口腔液混合，加入cacl2溶液和水，混勻得到口腔消化物；將口腔消化物和模擬胃液混合，加入cacl2溶液、胃脂肪酶、胃蛋白酶和水，攪拌得到胃消化物；將胃消化物和模擬小腸液混合，加入cacl2溶液、胰蛋白酶、胰脂肪酶、膽鹽和水，攪拌得到小腸消化物；小腸消化物離心，得到未消化固體殘?jiān)托∧c消化液，將8～12％v/v的小腸消化液和未消化固體殘?jiān)D(zhuǎn)移至腸道培養(yǎng)基中，得到含有小腸消化物的腸道培養(yǎng)基；

33、其中，樣品包括淀粉、乳清蛋白、脂肪酸；

34、模擬口腔液由kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o、(nh4)2co3和水配制得到；

35、模擬胃液由nacl、kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o、(nh4)2co3和水配制得到；

36、模擬小腸液由nacl、kcl、nahco3、kh2po4、mgcl2·6h2o和水配制得到；

37、將人工腸道菌群接種于含有小腸消化物的腸道培養(yǎng)基，發(fā)酵得到結(jié)腸酵解液；

38、將人工腸道菌群接種于腸道培養(yǎng)基得到含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基；

39、人工腸道菌群由prevotella?copri?atcc-33547、faecalibacteriumprausnitzii?atcc-27768、roseburia?faecis?mingzhoubio-b84313、bifidobacteriumlongum?atcc-15707、ruminococcus?bromii?atcc-27255、bifidobacterium?adolescentisatcc-15707、bacteroides?uniformis?atcc-25285、collinsella?aerofaciens?atcc-25986、ruminococcus?gnavus?atcc-29149和akkermansia?muciniphila?atcc-baa-835按照活菌數(shù)(108cfu/ml)比例0.10～0.30：0.10～0.30：0.05～0.20：0.05～0.20：0.05～0.20：0.005～0.1：0.005～0.1：0.01～0.03：0.01～0.03：0.01～0.03組成；

40、(2)制備具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型

41、使用基質(zhì)膠重懸類器官，鋪于transwell上室中，培養(yǎng)；將甲基纖維素、聚乙二醇二丙烯酸酯、粘蛋白、甲基丙烯?；髂z、甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?膦氧化物和含有人工腸道菌群的腸道培養(yǎng)基混合，鋪于步驟(1)的基質(zhì)膠上，固化得到水凝膠層；transwell上室中，步驟(2)的水凝膠層表面加入結(jié)腸酵解液；transwell下室中，加入類器官培養(yǎng)基，得到具有三層結(jié)構(gòu)的結(jié)腸類器官與菌群共培養(yǎng)的模型。

42、本發(fā)明的有益效果：

43、本發(fā)明有效協(xié)調(diào)氧氣需求：通過(guò)氧氣梯度控制，本發(fā)明解決了類器官和腸道菌群對(duì)不同氧氣需求的協(xié)調(diào)問(wèn)題，使其能夠在同一系統(tǒng)中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間共培養(yǎng)。該創(chuàng)新設(shè)計(jì)大大提升了類器官與菌群共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的可靠性和精確性。

44、本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，時(shí)間縮短：采用藍(lán)光固化技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成水凝膠層的固化及模型構(gòu)建，極大縮短了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間，并簡(jiǎn)化了類器官與菌群共培養(yǎng)的復(fù)雜流程。

45、本發(fā)明高效模擬體內(nèi)環(huán)境：多層水凝膠結(jié)構(gòu)及氧氣梯度調(diào)控，使類器官與菌群在模擬的體外環(huán)境中能夠更精確地進(jìn)行相互作用，提供了更接近生理?xiàng)l件的腸道微環(huán)境，適合長(zhǎng)時(shí)間的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，尤其在腸道代謝研究中表現(xiàn)出高效性。

46、本發(fā)明廣泛適用性、可重復(fù)性和精確性：該快篩模型設(shè)計(jì)合理，實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)之間的變異性，從而大大提高了研究的可靠性。