本發(fā)明涉及一種快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組及應(yīng)用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、野生鳥類的棲息和遷徙行為以及獨(dú)特的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)為許多病毒物種提供了天然的儲藏庫，也為致病性病毒的爆發(fā)與傳播提供了更多可能。人類對野生鳥類自然棲息地的入侵、野生鳥類被馴化以及人類對家禽消費(fèi)的增加，使得人類棲息地有較大的活動重疊區(qū)域，導(dǎo)致野生動物與家養(yǎng)禽類，以及動物群體內(nèi)部的相互作用增加，遷徙的鳥類與家禽之間傳播，間接傳給人類，為禽類病毒的跨物種傳播提供了機(jī)會，野生鳥類與家養(yǎng)禽類之間的互相傳播，這在家禽中值得關(guān)注。

2、目前市面上已有的檢測技術(shù)主要有檢測鴨源病毒、鴿源病毒、雞源病毒及細(xì)菌的檢測方法，而對于野生鳥類身上攜帶的重要病原體并不常見。而鳥類身上攜帶的傳染性病原體卻常有報(bào)道。比如2013年爆發(fā)的h7n9亞型禽流感，病毒基因來源于東亞地區(qū)的野鳥和家禽之間發(fā)生的基因重配，而h9n2亞型在我國廣泛存在，是當(dāng)前禽流感流行的主要亞型；西尼羅河病毒的美洲地區(qū)有超1.6萬例感染；1926年，新城疫病毒在南美洲、亞洲、歐洲和非洲的100多個國家都有報(bào)道，該病具有很高的發(fā)病率和病死率。

3、本發(fā)明根據(jù)野生鳥類身上攜帶的病原譜確定了四種病原體，分別是：禽流感病毒h9亞型(avian?influenzavirus)、冠狀病毒(γ、δ屬)(coronavirus)、新城疫病毒(newcastledisease?virus)、西尼羅河病毒(westnile?virus)，其中禽流感病毒屬于甲型流感病毒，極易發(fā)生重組變異產(chǎn)生多種亞型，主要引起呼吸系統(tǒng)病變，高致病性亞型甚至?xí)?dǎo)致宿主全身性敗血癥，可感染多種鳥類和哺乳動物。冠狀病毒普遍存在于世界各地的野鳥中，是γ冠狀病毒和δ冠狀病毒的天然宿主。新城疫病毒引起的新城疫是最具破壞性的疾病之一，傳播速度極快，強(qiáng)毒株可使雞群全群毀滅，嚴(yán)重削弱了全球家禽業(yè)；其基因組是一種非分段的，負(fù)義的單鏈rna。受感染人類主要有結(jié)膜炎或淋巴腺炎等癥狀；西尼羅河病毒(west?nile?virus，wnv)屬于黃病毒科的一員，人類的感染與發(fā)熱性疾病有關(guān)，其可以進(jìn)展為致命得腦炎，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和弛緩性麻痹。

4、因此，本發(fā)明建立一種能夠快速檢測野生鳥類攜帶致病性病毒的試劑對于防范和控制野鳥傳播的疫病具有重要的意義。多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)來檢測野生鳥類攜帶的主要病原體方面具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、時間短、成本低廉的優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對鳥類疫源疫病檢疫的需求，本發(fā)明的目的之一是提供一種快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組。

2、所述四重?zé)晒舛縫cr引物探針包括針對冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒的特異性引物和探針，其中冠狀病的上游引物如seq?id?no:1所示，下游引物如seq?id?no:2所示，探針如seq?id?no:3所示，新城疫病毒的上游引物如seq?id?no:4所示，下游引物如seq?id?no:5所示，探針如seq?id?no:6所示，禽流感病毒h9的上游引物如seq?id?no:7，下游引物如seq?id?no:8所示，探針如seq?id?no:9所示，西尼羅河病毒的上游引物如seq?id?no:10所示，下游引物如seq?id?no:11所示和探針如seq?id?no:12所示。

3、本發(fā)明的另一目的是提供一種快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組在檢測鳥類冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒中的應(yīng)用。

4、優(yōu)選的，具體步驟包括：

5、(1)用rna提取試劑盒提取咽拭子、肛拭子、糞便或組織樣品中的rna。

6、(2)以步驟(1)得到的rna為模板，采用seq?id?no:1～seq?id?no:12所示引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr檢測，根據(jù)ct值進(jìn)行結(jié)果判定。

7、優(yōu)選的，步驟(2)中熒光定量pcr檢測的反應(yīng)體系為2×pro?taqhs?probe?premixⅱ為20μl，模板4μl，禽流感病毒h9的上游、下游引物用量各為1ul，新城疫病毒、西尼羅河病毒的上游、下游引物用量各為1.2ul，禽流感病毒h9的探針用量為0.5ul，冠狀病毒、新城疫病毒、西尼羅河病毒探針用量各為0.6ul，加入無菌水補(bǔ)充至40μl。

8、優(yōu)選的，步驟(2)中熒光定量pcr檢測的反應(yīng)程序?yàn)?2℃逆轉(zhuǎn)錄5min；95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，56℃退火并延伸30s，40個循環(huán)；在每個循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號。

9、檢測結(jié)果判讀包括如下內(nèi)容：(1)擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)“s”型且無異常波動，陰性對照組、無模板對照組無ct值，實(shí)驗(yàn)視為有效，如不符合須再次進(jìn)行多重?zé)晒舛縫cr檢測，或重新提取核酸進(jìn)行四重?zé)晒舛縫cr檢測；(2)病原體ct值≤36.0，則為陽性，若36＜ct≤40，復(fù)檢一次仍是36＜ct≤40，則為陰性；(3)ct值顯示undft，樣本低于檢測限，結(jié)果為陰性。

10、本發(fā)明的有益效果

11、本發(fā)明首次建立的鳥類攜帶四種致病性病原體的多重?zé)晒舛縫cr檢測方法，對該方法進(jìn)行特異性評價(jià)發(fā)現(xiàn)病原體之間均無交叉反應(yīng)，且特異性良好，能準(zhǔn)確地對4種病毒進(jìn)行區(qū)分，靈敏度評價(jià)，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒h9、西尼羅河病毒檢測下限均可達(dá)到102copies/μl數(shù)量級，而冠狀病毒、新城疫病毒靈敏度可達(dá)到10copies/μl；對該方法進(jìn)行重復(fù)性評價(jià)發(fā)現(xiàn)各組病原體在批間和批內(nèi)的變異系數(shù)(cv)均小于5，重復(fù)性良好。

技術(shù)特征：

1.一種快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組，其特征在于：所述四重?zé)晒舛縫cr引物探針包括針對冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒的特異性引物和探針，其中冠狀病的上游引物如seq?id?no:1所示，下游引物如seq?id?no:2所示，探針如seq?id?no:3所示，新城疫病毒的上游引物如seq?id?no:4所示，下游引物如seq?id?no:5所示，探針如seq?id?no:6所示，禽流感病毒h9的上游引物如seq?id?no:7，下游引物如seq?id?no:8所示，探針如seq?id?no:9所示，西尼羅河病毒的上游引物如seq?idno:10所示，下游引物如seq?id?no:11所示和探針如seq?id?no:12所示。

2.權(quán)利要求1所述快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組在檢測鳥類冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組在檢測鳥類冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒中的應(yīng)用，其特征在于：具體步驟包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組在檢測鳥類冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒中的應(yīng)用，其特征在于：步驟(3)中熒光定量pcr檢測的反應(yīng)體系為2×pro?taqhs?probe?premixⅱ為20μl，cdna4μl，禽流感病毒h9的上游、下游引物用量各為1ul，新城疫病毒、西尼羅河病毒的上游、下游引物用量各為1.2ul，禽流感病毒h9的探針用量為0.5ul，冠狀病毒、新城疫病毒、西尼羅河病毒探針用量各為0.6ul，加入無菌水補(bǔ)充至40μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縫cr引物探針組在檢測鳥類冠狀病毒、新城疫病毒、禽流感病毒h9、西尼羅河病毒中的應(yīng)用，其特征在于：步驟(3)中熒光定量pcr檢測的反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，56℃退火并延伸30s，40個循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種快速檢測鳥類四種病原體的四重?zé)晒舛縋CR引物探針組及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其包括針對冠狀病毒(γ、δ屬)、禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、西尼羅河病毒的特異性引物和探針；本發(fā)明試劑用于鳥類攜帶的4種病毒的檢測，具有特異性高、敏感性強(qiáng)、檢測時間短，安全等優(yōu)勢，成本低的優(yōu)點(diǎn)；本方法可實(shí)現(xiàn)鳥類攜帶的病原體的檢出，對海關(guān)邊防檢疫工作具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：夏雪山,段憶萌,王炳輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：昆明理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2