本發(fā)明涉及酶工程，特別是涉及一種氨肽酶突變體及其制備方法和其用于制備l-肌肽的用途。

背景技術(shù)：

1、l-肌肽又名β-丙氨酰-l-組氨酸，是由β-丙氨酸和l-組氨酸兩種氨基酸縮合得到的二肽，是一種白色的結(jié)晶狀固體，是生物體內(nèi)存在的一種天然抗氧化劑。左旋肌肽作為一種天然二肽，在動(dòng)物的肌肉、腦組織、眼部晶狀體組織中大量存在，濃度可高達(dá)20?mm。在生物體內(nèi)，肌肽具有ph緩沖，抗氧化、抗自由基以及抗衰老等作用。在臨床上，應(yīng)用于減輕視覺(jué)疲勞、治療白內(nèi)障；含鋅肌肽可用于治療胃潰瘍。此外肌肽及其衍生產(chǎn)品在食品添加劑、化妝品、保健品等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、l-肌肽的生產(chǎn)有多種方法。由于肌肽在動(dòng)物肌肉中含量較高，早期直接從動(dòng)物組織中進(jìn)行肌肽的提取，這種方式產(chǎn)量低，純度差，早已被淘汰。目前通常采用的方法是化學(xué)合成法，使用鄰苯二甲酸酐對(duì)丙氨酸進(jìn)行氨基保護(hù)，使用二氯亞砜進(jìn)行羧基活化，然后與三甲基硅烷保護(hù)的l-組氨酸反應(yīng)，得到基團(tuán)保護(hù)的肌肽衍生物，隨后脫保護(hù)獲得游離的l-肌肽。這種方法收率較高，但是反應(yīng)步驟較多，反應(yīng)條件比較苛刻，反應(yīng)過(guò)程中需要計(jì)量消耗和生成大量對(duì)環(huán)境有害的試劑，并且鄰苯二甲?；拿摫Ｗo(hù)需要使用劇毒的試劑肼，而產(chǎn)品l-肌肽中不允許有肼的殘留，因此對(duì)產(chǎn)品的提取、精制有很高的要求?？偟膩?lái)說(shuō)，雖然化學(xué)合成法發(fā)展較早，但普遍需要復(fù)雜的保護(hù)-去保護(hù)步驟，存在著合成步驟繁瑣，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)品收率低，污染大，存在有毒試劑殘留等問(wèn)題。

3、與之相比，生物合成法具有合成路線短、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，更適合于工業(yè)應(yīng)用，將逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法。氨肽酶可以催化β-丙氨酸或β-丙氨酸甲酯和l-組氨酸縮合生成l-肌肽，反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)步驟少，工藝簡(jiǎn)單，效率高，條件溫和，整個(gè)過(guò)程綠色環(huán)保，因此具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。但現(xiàn)有的氨肽酶對(duì)l-組氨酸催化活性低，導(dǎo)致肌肽產(chǎn)量低下，因此有必要開(kāi)發(fā)催化活性高的氨肽酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種氨肽酶突變體及其制備方法和其用于制備l-肌肽的用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供氨肽酶突變體，所述氨肽酶突變體為在氨基酸序列如seq?id?no.2所示的野生型氨肽酶上進(jìn)行突變后得到的蛋白質(zhì)，突變位點(diǎn)選自如下中的任一個(gè)或多個(gè)：第82位、第90位、第98位、第105位、第117位、第132位、第137位、第144位、第145位、第150位、第183位、第186位、第223位、第278位、第283位、第319位或第325位。

3、本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼前述的氨肽酶突變體。

4、本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括所述的分離的多核苷酸。

5、本發(fā)明還提供一種工程化細(xì)胞，所述工程化細(xì)胞中含有所述的核酸構(gòu)建體或基因組中整合有外源的所述的分離的多核苷酸。

6、本發(fā)明還提供所述氨肽酶的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)所述工程化細(xì)胞，誘導(dǎo)氨肽酶表達(dá)并繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并分離即得到所述氨肽酶的酶液。

7、本發(fā)明還提供所述氨肽酶、所述分離的多核苷酸、所述核酸構(gòu)建體或所述工程化細(xì)胞在制備l-肌肽中的用途。

8、本發(fā)明還提供一種合成l-肌肽的方法，所述方法包括如下步驟：將所述氨肽酶與l-組氨酸和β-丙氨酸甲酯混合后反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集上清即得到l-肌肽。

9、如上所述，本發(fā)明的氨肽酶突變體及其制備方法和其用于制備l-肌肽的用途，具有以下有益效果：與野生型氨肽酶相比，底物轉(zhuǎn)化率從41%提高到95%。突變體的催化效率明顯提升，實(shí)現(xiàn)了肌肽的高效合成。使用相對(duì)廉價(jià)的β-丙氨酸甲酯作為原料，降低工業(yè)化應(yīng)用成本，為肌肽的合成提供了補(bǔ)充方案，對(duì)肌肽的綠色催化合成及工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種氨肽酶突變體，其特征在于，所述氨肽酶突變體為在氨基酸序列如seq?id?no.2所示的野生型氨肽酶上進(jìn)行突變后得到的蛋白質(zhì)，所述氨肽酶突變體包括w90h和n105y突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶突變體，其特征在于，所述氨肽酶突變體包括以下任一種突變：w90h/n105y/i325q、w90h/n105y/d132n/i325q或w90h/n105y/d132n/e278d/i325q。

3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1~2任一所述的氨肽酶突變體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括如seq?idno.13所示的核苷酸序列。

5.一種核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述核酸構(gòu)建體包括權(quán)利要求3或4所述的分離的多核苷酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述核酸構(gòu)建體為真核表達(dá)載體或原核表達(dá)載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述原核表達(dá)載體選自大腸桿菌表達(dá)載體、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體或鏈霉菌表達(dá)載體。

8.一種工程化細(xì)胞，其特征在于，所述工程化細(xì)胞中含有權(quán)利要求5~7任一所述的核酸構(gòu)建體或基因組中整合有外源的權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸。

9.權(quán)利要求1~2任一所述的氨肽酶突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化細(xì)胞，誘導(dǎo)氨肽酶表達(dá)并繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并分離即得到所述氨肽酶的酶液。

10.權(quán)利要求1~2任一所述的氨肽酶突變體、權(quán)利要求3或4所述的分離的多核苷酸、權(quán)利要求5~7任一所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求8所述的工程化細(xì)胞在制備l-肌肽中的用途。

11.一種合成l-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：將權(quán)利要求1~2任一所述的氨肽酶突變體或權(quán)利要求9所述的制備方法得到的氨肽酶與l-組氨酸和β-丙氨酸甲酯混合后反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集上清即得到l-肌肽。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，還包括如下特征中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種氨肽酶突變體及其制備方法和其用于制備L?肌肽的用途。所述氨肽酶突變體由野生型氨肽酶突變所得，能夠以β?丙氨酸甲酯和L?組氨酸逆水解制備L?肌肽。使用本發(fā)明氨肽酶突變體生產(chǎn)L?肌肽具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)化率≥95%，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，可以使用相對(duì)廉價(jià)的丙氨酸甲酯作為原料催化制備L?肌肽；2.生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，符合綠色化學(xué)理念。

技術(shù)研發(fā)人員：李佳成,卞雨花,楊建花,彭玲玲,吳鋒,喻紅忠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海昱菘生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2