本發(fā)明屬于生物科學(xué)與，具體涉及一種高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

1、辣椒(capsicumannuuml.)是一種全球廣泛種植的蔬菜和調(diào)味品作物，具有重要的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。近些年來，我國辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其播種面積常年穩(wěn)定在2×106hm2以上，占全國蔬菜總播種面積的8％～10％，其種植面積和產(chǎn)值效益均居蔬菜首位。

2、植物原生質(zhì)體是去掉了細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。原生質(zhì)體瞬時表達(dá)檢測是一種快速的、高通量的分析系統(tǒng)，被廣泛地用于亞細(xì)胞定位、蛋白互作、基因表達(dá)與調(diào)控、物質(zhì)跨膜運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁再生等基礎(chǔ)理論研究。另外，由于沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體易攝入外源遺傳物質(zhì)，其在一定條件下能再生細(xì)胞壁并重新發(fā)育為完整植株。這些特性使植物原生質(zhì)體成為生物育種研究很好的實驗材料。

3、酶解分離法是目前制備高等植物原生質(zhì)體的常用方法。通常是將植物葉片切成細(xì)絲后進(jìn)行酶解，當(dāng)獲得數(shù)量足夠的原生質(zhì)體后，再利用聚乙二醇(peg)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等方法進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化。比如2023年4月4日公開的公開號為cn?115896000a的中國發(fā)明專利，公開了一種辣椒原生質(zhì)體的分離及瞬時轉(zhuǎn)化方法：取辣椒植株第5～7片真葉進(jìn)行酶解，得到含辣椒葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的酶解混合液，將所述酶解混合液過濾，濾液離心后得到原生質(zhì)體沉淀，重懸后獲得辣椒原生質(zhì)體混懸液，再利用peg介導(dǎo)法進(jìn)行外源基因的瞬時轉(zhuǎn)化。通過實驗證明：利用該發(fā)明的分離方法得到的辣椒原生質(zhì)體的產(chǎn)量高達(dá)11.09～11.79×106個/gfw，最高瞬時轉(zhuǎn)化效率達(dá)64％。然而，該發(fā)明中的葉片切成細(xì)絲，容易受到機械損傷，進(jìn)而產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，從而不利于原生質(zhì)體的后續(xù)實驗。此外，peg介導(dǎo)法中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率受多種因素影響，例如peg濃度、質(zhì)粒用量、原生質(zhì)體活力、轉(zhuǎn)化時間等，這導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效果不夠穩(wěn)定。因此建立一整套高效、簡易的辣椒原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化方法至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，先利用含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染辣椒葉片，當(dāng)目標(biāo)基因成功表達(dá)后再撕下葉片下表皮，然后通過酶解法獲得完成轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，省去了peg轉(zhuǎn)化的步驟，避免了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中的諸多不穩(wěn)定因素，也避免了機械損傷對原生質(zhì)體的影響。

2、本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

3、一種高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

4、1)將攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液注射到辣椒葉片，黑暗條件下培養(yǎng)后，再移至溫室培養(yǎng)；

5、2)步驟1)培養(yǎng)后的辣椒葉片上表皮貼緊膠帶，按壓后，沿主葉脈用力撕去下表皮，上表皮粘在膠帶上；將粘有葉片的膠帶暴露出葉肉細(xì)胞的一側(cè)浸泡在酶解液中，酶解后，過濾，濾液離心，棄上清液，加入w5溶液重懸細(xì)胞。

6、步驟1)中，將攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液用去除針尖后的注射器注射至辣椒葉片，標(biāo)記好注射部位；

7、步驟1)中，攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液的od600值為0.6～0.8。

8、步驟1)中，所述攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌是指攜帶pbingfp3載體的農(nóng)桿菌；

9、步驟1)中，攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液注射量為滿葉注射，一般根據(jù)葉片大小，每葉注射2～3ml；

10、步驟1)中，所述黑暗條件下培養(yǎng)，是指：將注射后的辣椒植株在25℃黑暗培養(yǎng)2h；

11、步驟1)中所述溫室培養(yǎng)是指：辣椒植株移至25℃、光照14h/黑暗10h溫室中培養(yǎng)2天。

12、步驟1)中，攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液的制備方法為：取攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌，進(jìn)行劃線活化，28℃黑暗培養(yǎng)2d；侵染液(現(xiàn)配現(xiàn)用)：10mm?2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)、10mm?mgcl2，200μmol/l乙酰丁香酮(as)，用naoh調(diào)節(jié)ph至5.0～5.4；用侵染液重懸農(nóng)桿菌菌體，6000rmp離心10分鐘沉淀菌體，去除上清后，每管加入適量的侵染液再次重懸農(nóng)桿菌，并稀釋至od600值為0.6～0.8。

13、步驟1)中，選取籽粒飽滿的辣椒成熟種子，在超凈工作臺中先用70％乙醇侵泡30sec，無菌水快速沖洗1次；再用0.1％升汞消毒6min，期間需不斷震蕩，確保滅菌徹底；無菌水沖洗3～4次；之后將滅菌后的種子倒入無菌的含有2層濾紙的培養(yǎng)皿中吹干5min，挑取籽粒接種于含有g(shù)m培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于25℃，70％相對濕度，14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)，待辣椒植株第4片真葉剛完全展開時，第1～2片無菌真葉作為供試材料；含有g(shù)m培養(yǎng)基的配方為：2.2g/l?ms粉末、15g/l蔗糖和2.7g/l植物凝膠(phytagel)，ph?5.72；

14、或者，步驟1)中，獲得辣椒葉片的方法為：將辣椒成熟的種子播于土壤中，在25℃，70％相對濕度，14h光照/10h黑暗條件下的溫室中生長，待辣椒植株第4片真葉剛完全展開時，第1～2片真葉作為供試材料。所述土壤為泥炭土和蛭石體積比3:1混勻的土壤；

15、步驟2)中，酶解條件為：25℃酶解3～4h。

16、步驟2)中，所述過濾，使用的經(jīng)過w5溶液潤洗之后的75μm尼龍網(wǎng)過濾；

17、步驟2)中，使用的酶解液配方為：1.25％(wt/vol)纖維素酶r10(cellulose?r10)、0.3％(wt/vol)離析酶r10(macerozyme?r10)，20mm?2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)(ph?5.7)，0.4m甘露醇(mannitol)，20mm?kcl，55℃加熱10min，冷卻至室溫后再加入10mm?cacl2，5mmβ-巰基乙醇，0.1％牛血清白蛋白(bsa)，加超純水補齊至10ml；其中wt/vol，wt的單位是g，vol的單位是ml；

18、步驟2)中，使用的w5溶液為：2mm?2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)(ph?5.7)，154mmnacl，125mm?cacl2，5mm?kcl，5mm葡萄糖，溶劑為超純水。

19、以上試劑均需要經(jīng)過0.22μm微孔過濾膜過濾滅菌。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明先利用含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染辣椒葉片，當(dāng)目標(biāo)基因成功表達(dá)后再撕下葉片下表皮，然后通過酶解法獲得完成轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，省去了peg轉(zhuǎn)化的步驟，避免了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中的諸多不穩(wěn)定因素，也避免了機械損傷對原生質(zhì)體的影響。本發(fā)明方法成本低、方便快捷、獲得原生質(zhì)體質(zhì)量好，轉(zhuǎn)化效率高，為辣椒遺傳改良和基礎(chǔ)理論研究提供技術(shù)支撐。

技術(shù)特征：

1.一種高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1)中，攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染液的od600值為0.6～0.8。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1)中，所述攜帶有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌是指攜帶pbingfp3載體的農(nóng)桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1)中，所述黑暗條件下培養(yǎng)，是指辣椒植株在25℃黑暗培養(yǎng)2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1)中所述溫室培養(yǎng)是指：移辣椒植株至25℃、光照14h/黑暗10h溫室中培養(yǎng)2天。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，酶解條件為：25℃酶解3～4h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，所述過濾，使用的經(jīng)過w5溶液潤洗之后的75μm尼龍網(wǎng)過濾。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，使用的酶解液配方為：1.25％纖維素酶r10、0.3％離析酶r10，20mm?2-(n-嗎啡啉)乙磺酸ph?5.7，0.4m甘露醇，20mm?kcl，55℃加熱10min，冷卻至室溫后再加入10mm?cacl2，5mmβ-巰基乙醇，0.1％牛血清白蛋白，加超純水補齊至10ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，使用的w5溶液為：2mm?2-(n-嗎啡啉)乙磺酸ph?5.7，154mm?nacl，125mm?cacl2，5mmkcl，5mm葡萄糖,溶劑為超純水。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率為75.33±1.85％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種高效快捷的辣椒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明先利用含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌侵染辣椒葉片，當(dāng)目標(biāo)基因成功表達(dá)后再撕去葉片下表皮，然后通過酶解法獲得完成轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，省去了PEG轉(zhuǎn)化的步驟，避免了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中的諸多不穩(wěn)定因素，也避免了機械損傷對原生質(zhì)體的影響。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法成本低、方便快捷、獲得的原生質(zhì)體質(zhì)量好，轉(zhuǎn)化效率高。

技術(shù)研發(fā)人員：程偉,儲謨立,白雪怡,劉麗,李雪琦,龔貝貝
受保護的技術(shù)使用者：安徽師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9