本發(fā)明屬于細(xì)胞體外培養(yǎng)，具體涉及一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代和純化方法。

背景技術(shù)：

1、鯉是我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖種類之一，為改良鯉的生長(zhǎng)、品質(zhì)、抗病等性狀，魚類育種學(xué)家采用群體選育、家系選育、雜交育種、分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)培育了32個(gè)鯉國(guó)家審定新品種。然而因鯉初次性成熟年齡普遍為2～3年，導(dǎo)致選育一個(gè)新品種至少需要8～12年，致使鯉新品種選育周期長(zhǎng)。因此如何克服長(zhǎng)世代間隔制約鯉新品種選育進(jìn)程是鯉遺傳選育的重大技術(shù)問題。魚類生殖干細(xì)胞移植為解決上述問題提供了可選的技術(shù)途徑。魚類生殖干細(xì)胞作為一種具有自我更新能力和產(chǎn)生配子(精子和卵子)潛能的特殊細(xì)胞類型，在生物生殖和遺傳多樣性維持中扮演著不可或缺的角色。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，生殖干細(xì)胞體外操作應(yīng)用前景廣泛，尤其在瀕危魚類種質(zhì)資源保護(hù)、新種質(zhì)創(chuàng)制、新品種培育中，其技術(shù)應(yīng)用潛力備受關(guān)注。利用生殖干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞移植技術(shù)與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，在細(xì)胞層面快速定向改變水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)性狀的遺傳特性，如增強(qiáng)病害抗性、增加生長(zhǎng)速度等，極大地縮短了育種周期，提高了育種效率。

2、卵原干細(xì)胞是卵巢中存在的具有自我更新和分化能力的一類生殖干細(xì)胞。卵原干細(xì)胞在魚類生殖干細(xì)胞培養(yǎng)與移植研究方面，盡管有多種魚類的卵原干細(xì)胞(如斑馬魚、黃鱔、鯰等魚類)已被成功分離并體外培養(yǎng)，但對(duì)于大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物而言，因其生活習(xí)性及其生物學(xué)特征的不同，特定的卵原干細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)尚需進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化。而鯉目前尚未有卵原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和保存的技術(shù)體系，制約了采用生殖干細(xì)胞移植技術(shù)來縮短優(yōu)良品種選育周期和提高鯉育種效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代和純化方法，建立鯉卵原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系，且建立的鯉卵原干細(xì)胞系純度高，具有良好的多能性。

2、本發(fā)明提供了一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將取自雌性鯉的卵巢在l-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基中浸泡后置于鯉血清中，將所述卵巢剪切成塊后均勻鋪在t25培養(yǎng)瓶中，在26～30℃且無co2環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6h后加入l-15完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，得到貼壁培養(yǎng)的原代鯉卵原干細(xì)胞；

3、所述l-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下成分：l-15粉末、5mol/lhepes緩沖液、50μmol/lβ-巰基乙醇、滅菌水；

4、所述l-15完全培養(yǎng)基以l-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下成分：體積百分含量為10～20％的胎牛血清、2～20ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2～20ng/ml的白血病抑制因子、體積百分含量為0.5～2％的鯉血清、體積百分含量為0.5～2％的斑馬魚胚胎提取物、體積百分含量為0.5～2％l-谷氨酰胺、600～1000iu/ml的青霉素、0.6～1mg/ml的鏈霉素和1～3μg/ml的兩性霉素b。

5、對(duì)所述雌性鯉進(jìn)行性別鑒定，鑒定用引物對(duì)包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的cyc-male?marker-f和seq?id?no.2所示的cyc-male?marker-r。

6、本發(fā)明還提供了利用上述體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系。

7、本發(fā)明還提供了上述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的傳代方法，包括以下步驟：

8、(1)所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的匯合度達(dá)到80％以上后，去除所述l-15完全培養(yǎng)基，利用pbs洗滌；

9、(2)在所述pbs洗滌后，利用pbs和0.25％胰酶-edta混合液消化4～6min，l-15完全培養(yǎng)基終止消化后，吸取液體并1000～1500rpm離心4～6min，去除上清，加入l-15完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液；(3)將步驟(2)收集的細(xì)胞懸液按照1：(2～4)的比例分配至新的t25培養(yǎng)瓶，加入l-15完全培養(yǎng)基后，在26～30℃且無co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

10、本發(fā)明還提供了上述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的純化方法，包括以下步驟：將所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系利用上述傳代方法，傳代至第3代后，進(jìn)行連續(xù)差速貼壁，得到純化的鯉卵原干細(xì)胞。

11、優(yōu)選的，所述連續(xù)差速貼壁包括連續(xù)4～6次傳代進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)。

12、優(yōu)選的，所述連續(xù)差速貼壁包括利用pbs和0.25％胰酶-edta混合液消化4～6min所述第3代鯉卵原干細(xì)胞，l-15完全培養(yǎng)基終止消化后吸取液體并1000～1500rpm離心4～6min，去除上清加入l-15完全培養(yǎng)基混勻后接種至培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)30～50min，吸取細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)皿中，完成一次差速貼壁培養(yǎng)。

13、本發(fā)明還提供了利用上述純化方法得到的純化的鯉卵原干細(xì)胞。

14、本發(fā)明還提供了上述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系或上述純化的鯉卵原干細(xì)胞的凍存液，包括l-15完全培養(yǎng)基、胎牛血清和dmso的混合液，或胎牛血清和dmso的混合液。

15、本發(fā)明還提供了上述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系或經(jīng)凍存并復(fù)蘇后的鯉卵原干細(xì)胞在培育鯉魚新品種中的應(yīng)用。

16、有益效果：本發(fā)明提供了一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括選取雌性鯉，分離卵巢組織，從卵巢組織中分離原代卵原干細(xì)胞后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，并對(duì)貼壁培養(yǎng)后的卵原干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)和純化。本發(fā)明還提供了對(duì)傳代并純化得到的卵原干細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存和復(fù)蘇。本發(fā)明利用組織貼壁法培養(yǎng)鯉卵原干細(xì)胞，第3天即可觀察到有長(zhǎng)條狀、三角形狀、不規(guī)則多邊形細(xì)胞從組織小塊中爬出，向四周延伸；經(jīng)細(xì)胞傳代后，鯉卵原干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

17、利用本發(fā)明所述體外培養(yǎng)方法經(jīng)傳代后，第3代鯉卵原干細(xì)胞中含有大量的成纖維細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁后，能夠去除部分成纖維細(xì)胞，經(jīng)過對(duì)鯉卵原干細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)差速貼壁，根據(jù)其形態(tài)學(xué)觀察對(duì)細(xì)胞純度進(jìn)行分析，第14代的鯉卵原干細(xì)胞純度能夠達(dá)到66.73％。且利用本發(fā)明所述方法進(jìn)行冷凍保存和復(fù)蘇后，復(fù)蘇成活率均在90％以上，對(duì)復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)良好，能夠清晰看到細(xì)胞輪廓，細(xì)胞核完整。

18、本發(fā)明經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代并純化以及冷凍保存并復(fù)蘇后的鯉卵原干細(xì)胞具有典型的生殖干細(xì)胞特征和多能性，克服了鯉新品種選育進(jìn)程的長(zhǎng)世代間隔制約，縮短優(yōu)良品種選育周期和提高鯉育種效率，為鯉的遺傳選育提供了重要技術(shù)基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：將取自雌性鯉的卵巢在l-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基中浸泡后，置于鯉血清中，將所述卵巢剪切成塊后均勻鋪在t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在26～30℃且無co2環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6h后加入l-15完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，得貼壁培養(yǎng)的原代鯉卵原干細(xì)胞；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述體外培養(yǎng)方法，其特征在于，當(dāng)雌性鯉性腺分化不明顯時(shí)，需要對(duì)選擇的鯉進(jìn)行性別鑒定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述性別鑒定包括利用pcr擴(kuò)增的方法進(jìn)行鑒定，所述pcr擴(kuò)增所用引物對(duì)包括核苷酸序列如seq?idno.1所示的cyc-malemarker-f和seq?id?no.2所示的cyc-male?marker-r。

4.利用權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述體外培養(yǎng)方法，培養(yǎng)得到的貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系。

5.權(quán)利要求4所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的傳代方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的匯合度達(dá)到80％以上后，去除所述l-15完全培養(yǎng)基，利用pbs洗滌；

6.權(quán)利要求4所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：將所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系利用權(quán)利要求5所述傳代方法，傳代至第3代后，進(jìn)行連續(xù)差速貼壁，得到純化的鯉卵原干細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述純化方法，其特征在于，所述連續(xù)差速貼壁包括連續(xù)4～6次傳代進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述純化方法，其特征在于，所述連續(xù)差速貼壁包括利用pbs和0.25％胰酶-edta混合液消化4～6min所述第3代鯉卵原干細(xì)胞，l-15完全培養(yǎng)基終止消化后吸取液體并1000～1500rpm離心4～6min，去除上清加入l-15完全培養(yǎng)基混勻后接種至培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)30～50min，吸取細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)皿中，完成一次差速貼壁培養(yǎng)。

9.權(quán)利要求4所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞系或利用權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述方法純化的鯉卵原干細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，所述凍存所用的凍存液，包括l-15完全培養(yǎng)基、胎牛血清和dmso的混合液，或胎牛血清和dmso的混合液。

10.權(quán)利要求4所述貼壁原代鯉卵原干細(xì)胞、權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述純化方法純化的鯉卵原干細(xì)胞或利用權(quán)利要求9所述凍存方法凍存并復(fù)蘇后的鯉卵原干細(xì)胞在培育鯉新品種的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代和純化方法，屬于細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種鯉卵原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括選取雌魚分離卵巢組織，從卵巢組織中分離原代卵原干細(xì)胞后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，并對(duì)貼壁培養(yǎng)后的卵原干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)和純化。本發(fā)明還提供了對(duì)傳代并純化得到的鯉卵原干細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存和復(fù)蘇。本發(fā)明利用組織貼壁法培養(yǎng)鯉卵原干細(xì)胞，第3天即可觀察到有長(zhǎng)條狀、三角形狀、不規(guī)則多邊形細(xì)胞從組織小塊中爬出，向四周延伸；經(jīng)細(xì)胞傳代后，鯉卵原干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。本發(fā)明經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代并純化以及冷凍保存并復(fù)蘇后的鯉卵原干細(xì)胞具有典型的生殖干細(xì)胞特征和多能性。

技術(shù)研發(fā)人員：匡友誼,閆婷,周慧杰,張婷婷,孫志鵬,尹亞姍,張?zhí)?徐歡
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2