本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物及應(yīng)用，具體地，涉及一種診斷結(jié)直腸癌的標(biāo)志物組合、方法、系統(tǒng)及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，腫瘤液體活檢領(lǐng)域?qū)τ赿na甲基化水平、插入片段大小和末端序列的檢測(cè)需求越來(lái)越迫切。dna甲基化水平是指dna分子上甲基基團(tuán)的添加與去除，它在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和疾病發(fā)展等方面起著重要作用。插入片段大小通常是指在二代測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建中利用超聲或者酶切技術(shù)將樣本中的dna分子進(jìn)行打斷獲得的dna片段的大小，末端序列是指dna分子兩端一定長(zhǎng)度的序列。

2、目前，現(xiàn)有的dna甲基化檢測(cè)方法包括wgbs和rrbs等重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后測(cè)序。然而，重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化dna有兩個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)，分別是dna損耗極大和破壞dna原有片段結(jié)構(gòu)。導(dǎo)致cfdna重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法檢測(cè)插入片段大小和末端序列，因此，目前插入片段大小分布和末端序列分布，一般使用wgs測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

2、本發(fā)明第一方面提供一種基于甲基化cfdna片段篩選用于診斷癌癥的標(biāo)志物的方法，包括以下步驟：

3、s1，獲得癌癥患者cfdna樣本和正常人cfdna樣本的片段序列信息和甲基化信息，所述甲基化信息包括甲基化位置和甲基化水平；

4、s2，對(duì)步驟s1獲得的片段序列信息和甲基化信息進(jìn)行如下分析得到候選標(biāo)志物水平譜：

5、（1）將人類全基因組按照長(zhǎng)度進(jìn)行劃分得到不同的基因組窗口，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到各基因組窗口的甲基化cfdna片段數(shù)目，基于所述甲基化信息獲得基因組窗口甲基化水平譜；

6、（2）基于不同長(zhǎng)度甲基化cfdna片段的數(shù)目，獲得不同步長(zhǎng)片段特征的頻率，得到片段特征頻率譜；

7、（3）獲得甲基化cfdna片段5'端4mer~6mer的末端序列的分布頻率，得到末端序列頻率譜，

8、由此，所述候選標(biāo)志物譜包括基因組窗口甲基化水平譜、片段特征頻率譜和末端序列頻率譜，

9、s3，基于步驟s2得到的候選標(biāo)志物水平譜篩選在癌癥患者和正常人中具有顯著差異的候選標(biāo)志物，即得到用于診斷癌癥的標(biāo)志物，包括基因組窗口、片段特征和末端序列。

10、在本發(fā)明中，cfdna全稱為“cell-free?dna”，即細(xì)胞游離dna，來(lái)源包括但不限于外周血、腦脊液、唾液、胸膜液、腹水、尿液及糞便。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述片段序列信息和甲基化信息是首先采用甲基化富集蛋白富集、免疫沉淀或酶轉(zhuǎn)法的方式獲取待測(cè)樣本的甲基化cfdna片段，進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序獲得的。這種方式在捕獲發(fā)生甲基化的cfdna的同時(shí)可以很好地保留cfdna的片段特征，以便后續(xù)同時(shí)檢測(cè)cfdna甲基化水平、插入片段大小和末端序列。

12、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在步驟s1和步驟s2之間，進(jìn)一步包括對(duì)片段信息進(jìn)行預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理包括：

13、（1）去除接頭序列；

14、（2）過(guò)濾超過(guò)40%的堿基的質(zhì)量值低于q15的低質(zhì)量序列；

15、（3）過(guò)濾含n超過(guò)5個(gè)的序列；

16、（4）過(guò)濾序列長(zhǎng)度小于30的序列（序列過(guò)短）；

17、（5）裁剪片段末端平均質(zhì)量<q20的4個(gè)堿基。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在癌癥患者cfdna樣本和正常人cfdna樣本中均加入甲基化標(biāo)準(zhǔn)品和未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述甲基化標(biāo)準(zhǔn)品為全甲基化陽(yáng)參λdna；所述未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品是指全不甲基化陰參λdna。

19、進(jìn)一步地，使用bowtie2-2.3.4.2軟件將清洗后測(cè)序數(shù)據(jù)的堿基序列分別比對(duì)到人類參考基因組hg19（grch37）和λdna參考基因組生成bam文件，并根據(jù)基因組坐標(biāo)對(duì)bam文件進(jìn)行排序，使用picard?markduplicates-2.18.25-snapshot對(duì)排序后的bam進(jìn)行去重，最后篩選配對(duì)reads均比對(duì)到參考基因組并且mapq>20的讀段。

20、根據(jù)全甲基化陽(yáng)參λdna和全不甲基化陰參λdna的比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)反應(yīng)特異率。優(yōu)選地，在步驟s1中，選取有效測(cè)序數(shù)據(jù)量大于第一預(yù)設(shè)閾值且反應(yīng)特異率大于第二預(yù)設(shè)閾值的甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)，其中，所述第一預(yù)設(shè)閾值為4g~9g，所述第二預(yù)設(shè)閾值為0.7~0.9。若沒(méi)有癌癥患者cfdna樣本或沒(méi)有正常人cfdna樣本的甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)滿足該要求，則重新進(jìn)行建庫(kù)并測(cè)序，或重新獲得樣本進(jìn)行建庫(kù)并測(cè)序。

21、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在步驟s2中，所述基因組窗口甲基化水平譜是基于以下步驟進(jìn)行的：

22、將人類全基因組按照長(zhǎng)度進(jìn)行劃分得到不同的基因組窗口，基于所述甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)于每個(gè)基因組窗口，統(tǒng)計(jì)該基因組窗口內(nèi)的甲基化cfdna片段數(shù)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到該基因組窗口內(nèi)的甲基化水平。

23、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，利用以下公式得到標(biāo)準(zhǔn)化的甲基化水平：

24、。

25、其中，所述全部甲基化cfdna片段數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，所述基因組窗口長(zhǎng)度以kb計(jì)。

26、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，按長(zhǎng)度為300bp進(jìn)行窗口劃分，則可以劃分為10318991個(gè)基因組窗口，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不同長(zhǎng)度進(jìn)行窗口劃分，也可在1~基因組大小范圍內(nèi)進(jìn)行窮舉劃分。

27、在本發(fā)明中，所述“片段特征”又叫“插入片段大小特征”，是指將甲基化cfdna片段按不同長(zhǎng)度（步長(zhǎng)）劃分為不同的片段區(qū)間。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述步長(zhǎng)為2bp~10bp。如步長(zhǎng)為2bp，則劃分的片段區(qū)間為61-62bp、63-64bp、……、399-400bp；如步長(zhǎng)3bp，則劃分的片段區(qū)間為61-63bp、64-66bp、……、397-399bp；如步長(zhǎng)10bp，則劃分的片段區(qū)間為61-70bp、71-80bp、……、391-400bp），每個(gè)片段區(qū)間包括的全部甲基化cfdna片段定義為片段特征。例如片段特征為：61-65bp，包括片段長(zhǎng)度為61bp、62bp、63bp、64bp和65bp的甲基化cfdna片段。又例如片段特征為：74-75bp，包括片段長(zhǎng)度為74bp和75bp的甲基化cfdna片段。

28、所述片段特征頻率是指一個(gè)片段特征中的甲基化cfdna片段數(shù)占總甲基化cfdna片段數(shù)的比例。

29、所述末端序列頻率是指一個(gè)擁有相同末端序列的甲基化cfdna片段數(shù)占總甲基化cfdna片段數(shù)的比例。

30、在本發(fā)明中，獲得甲基化cfdna片段5'端末端4mer（如ccgt、agtt等）和6mer（如ccgatc、tcggat等）兩種長(zhǎng)度的末端序列的分布頻率。

31、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在步驟s3中，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)或機(jī)器學(xué)習(xí)方法在癌癥患者和正常人中具有顯著差異的候選標(biāo)志物。

32、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，在步驟s3中，所述機(jī)器學(xué)習(xí)方法包括邏輯回歸、決策樹(shù)、隨機(jī)森林、支持向量機(jī)、樸素貝葉斯、k最近鄰和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

33、本發(fā)明第二方面提供一種基于甲基化cfdna片段篩選用于診斷癌癥的標(biāo)志物的系統(tǒng)，包括：

34、甲基化數(shù)據(jù)輸入模塊，用于接收癌癥患者cfdna樣本和正常人cfdna樣本的片段序列信息和甲基化信息；

35、基因組數(shù)據(jù)存儲(chǔ)模塊，用于存儲(chǔ)人基因組數(shù)據(jù)；

36、數(shù)據(jù)對(duì)比模塊，分別與所述甲基化數(shù)據(jù)輸入模塊及所述基因組數(shù)據(jù)存儲(chǔ)模塊連接，用于將所述片段信息和所述甲基化信息與所述人基因組數(shù)據(jù)比對(duì)；

37、分析模塊，與所述數(shù)據(jù)對(duì)比模塊連接，用于進(jìn)行如下分析得到候選標(biāo)志物水平譜：

38、（1）將人類全基因組按照長(zhǎng)度進(jìn)行劃分得到不同的基因組窗口，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到各基因組窗口的甲基化片段的數(shù)目，基于所述甲基化信息獲得基因組窗口甲基化水平譜；

39、（2）基于不同長(zhǎng)度甲基化cfdna片段的數(shù)目，獲得不同步長(zhǎng)片段特征的頻率，得到片段特征頻率譜；

40、（3）獲得甲基化cfdna片段5'端4mer~6mer的末端序列的分布頻率，得到末端序列頻率譜，

41、篩選模塊，與所述分析模塊連接，用于基于所述候選標(biāo)志物水平譜篩選在癌癥患者和正常人中具有顯著差異的候選標(biāo)志物。

42、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述甲基化數(shù)據(jù)輸入模塊還用于對(duì)所述片段序列信息進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括：

43、（1）去除接頭序列；

44、（2）過(guò)濾超過(guò)40%的堿基的質(zhì)量值低于q15的低質(zhì)量序列；

45、（3）過(guò)濾含n超過(guò)5個(gè)的序列；

46、（4）過(guò)濾序列長(zhǎng)度小于30的序列（序列過(guò)短）；

47、（5）裁剪片段末端平均質(zhì)量<q20的4個(gè)堿基。

48、本發(fā)明第三方面提供一種用于診斷癌癥的標(biāo)志物組合，包括利用本發(fā)明第一方面任一所述的方法或本發(fā)明第二方面任一所述的系統(tǒng)篩選得到的標(biāo)志物。

49、本發(fā)明第四方面提供另一種用于診斷癌癥的標(biāo)志物組合，包括：

50、（1）由chr15:31775701-31776000、chr7:32467501-32467800、chr8:24771301-24771600組成的基因組窗口組合中的至少一個(gè)；

51、（2）由165-166bp、163-165bp、167-168bp組成的片段特征組合中的至少一個(gè)；和

52、（3）由atgggg、ataggc、atgagg組成的末端序列組合中的至少一個(gè)，

53、優(yōu)選地，所述癌癥為結(jié)直腸癌；

54、或者包括：

55、（1）由chr7:32467501-32467800、chr7:32467801-32468100和chr20:21376801-21377100組成的基因組窗口組合中的至少一個(gè)；

56、（2）由149-150bp、151-152bp和153-154bp組成的片段特征組合中的至少一個(gè)；和

57、（3）由atgagc、atgg、atagcg組成的末端序列組合中的至少一個(gè)，

58、優(yōu)選地，所述癌癥為肝癌；

59、或者包括：

60、（1）由chr20:43726801-43727100、chr6:107955901-107956200和chr19:19650901-19651200組成的基因組窗口組合中的至少一個(gè)；

61、（2）由279-280bp、277-279bp和280-282bp組成的片段特征組合中的至少一個(gè)；和

62、（3）由ctaggg、ttcagc、ataggc組成的末端序列組合中的至少一個(gè)，

63、優(yōu)選地，所述癌癥為胰腺癌；

64、或者包括：

65、（1）由chr7:32467501-32467800、chr6:107955901-107956200和chr2:39187201-39187500組成的基因組窗口組合中的至少一個(gè)；

66、（2）由163-164bp、165-166bp和156-160bp組成的片段特征組合中的至少一個(gè)；和

67、（3）由agggag、agggga、tgaaac組成的末端序列組合中的至少一個(gè)，

68、優(yōu)選地，所述癌癥為胃癌；

69、或者包括：

70、（1）由chr3:51740701-51741000、chr9:140128201-140128500和chr17:7670401-7670700組成的基因組窗口組合中的至少一個(gè)；

71、（2）由267-268bp、259-260bp和268-270bp組成的片段特征組合中的至少一個(gè)；和

72、（3）由gggaac、gggagt、gggaag組成的末端序列組合中的至少一個(gè)，

73、優(yōu)選地，所述癌癥為肺癌。

74、本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明第三方面或第四方面所述的標(biāo)志物組合的檢測(cè)試劑和/或裝置在制備用于診斷癌癥的試劑盒中的應(yīng)用。

75、本發(fā)明第六方面提供一種計(jì)算機(jī)設(shè)備，包括：

76、存儲(chǔ)器，用于存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)程序；

77、處理器，用于執(zhí)行所述計(jì)算機(jī)程序時(shí)實(shí)現(xiàn)如本發(fā)明第一方面所述的一種基于甲基化cfdna片段篩選用于診斷癌癥的標(biāo)志物的方法的步驟。

78、本發(fā)明第七方面提供一種計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上存儲(chǔ)有計(jì)算機(jī)程序，所述計(jì)算機(jī)程序被處理器執(zhí)行時(shí)實(shí)現(xiàn)如本發(fā)明第一方面所述的一種基于甲基化cfdna片段篩選用于診斷癌癥的標(biāo)志物的方法的步驟。

79、本發(fā)明第八方面提供一種用于診斷癌癥的系統(tǒng)，包括以下模塊：

80、標(biāo)志物數(shù)據(jù)輸入模塊，用于輸入本發(fā)明第三方面或第四方面所述的標(biāo)志物組合中各標(biāo)志物的水平；

81、癌癥判斷模塊，與所述數(shù)據(jù)輸入模塊連接，用于根據(jù)所述標(biāo)志物組合中各標(biāo)志物的水平判斷受試者是否患有癌癥或者是否具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

82、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)志物組合包括基因組窗口、片段特征和/或末端序列。

83、當(dāng)標(biāo)志物為基因組窗口時(shí)，其水平是指甲基化水平，基于比對(duì)到該基因組窗口的甲基化cfdna片段數(shù)目獲得。

84、當(dāng)標(biāo)志物為片段特征時(shí)，其水平是指片段特征頻率。

85、當(dāng)標(biāo)志物為末端序列時(shí)，其水平是指末端序列頻率。

86、進(jìn)一步地，本發(fā)明人提供了一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)存儲(chǔ)有計(jì)算機(jī)程序指令，其中當(dāng)該計(jì)算機(jī)程序指令被處理器執(zhí)行時(shí)，本發(fā)明上述任一所述方法被運(yùn)行。

87、更進(jìn)一步地，本發(fā)明人提出了一種設(shè)備，該設(shè)備包括：

88、用于存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)程序指令的存儲(chǔ)器，和用于執(zhí)行所述計(jì)算機(jī)程序指令的處理器，其中當(dāng)所述計(jì)算機(jī)程序指令被所述處理器執(zhí)行時(shí)，該設(shè)備運(yùn)行本發(fā)明上述任一方法。

89、在本發(fā)明中，所述癌癥包括實(shí)體瘤和血癌，如直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、腎癌、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、黑色素瘤；白血病，如急性淋巴細(xì)胞性白血病和急性成髓細(xì)胞性白血?。ǔ伤杓?xì)胞、前髓細(xì)胞、髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞白血?。?；慢性白血?。运杓?xì)胞（粒細(xì)胞）白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病）等。

90、本發(fā)明的有益效果

91、該方法結(jié)合了先進(jìn)的甲基化cfdna測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)方法，具有高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。

92、在本發(fā)明的方法中，首先通過(guò)蛋白富集、免疫沉淀法或酶轉(zhuǎn)法的方式獲取待測(cè)樣本的甲基化cfdna片段，在捕獲發(fā)生甲基化的cfdna片段的同時(shí)可以很好地保留cfdna的片段特征，以便后續(xù)同時(shí)檢測(cè)cfdna甲基化水平、插入片段大小和末端序列。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括甲基化數(shù)據(jù)輸入模塊、基因組數(shù)據(jù)存儲(chǔ)模塊、數(shù)據(jù)對(duì)比模塊、分析模塊及篩選模塊。

93、本發(fā)明的方法和系統(tǒng)能夠同時(shí)檢測(cè)cfdna甲基化水平、片段特征和末端序列，為疾病診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。