本發(fā)明涉及生物分析，尤其涉及一種基于rpa-cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器用于microrna一鍋法檢測的方法。

背景技術(shù)：

1、大量研究證明，mirna通過調(diào)控相關(guān)基因的表達水平參與一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，在細胞生長、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。同時，作為人體組織和細胞中豐富的新興生物標志物之一，mirna具有抑制細胞凋亡和促進細胞增殖的作用，在肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌等多種癌癥組織中也發(fā)現(xiàn)了其異常表達。因此，準確、靈敏地測定mirna的表達水平可為癌癥的診斷、發(fā)病機制探索和治療干預(yù)提供有利證據(jù)。一般來說，northern印跡技術(shù)是廣泛應(yīng)用的分析mirnas的標準方法，但其本身存在靈敏度不夠和所需樣本量大的缺點。因此，由于mirnas序列短，其家族成員之間序列同源性高，且在總樣本中的濃度通常很低，因此超靈敏檢測mirnas仍是一項重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

2、具體來說，crispr系統(tǒng)集成了分子識別元件和靈活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊，使其成為構(gòu)建基于dna的信號放大方案的潛在可編程平臺。為了提高平臺的靈敏度，目前的核酸檢測方法通常需要一個信號放大步驟。傳統(tǒng)的擴增方法基于聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)，需要熱循環(huán)儀進行微妙的溫度調(diào)節(jié)。然而，這些擴增方法通常需要不同程度的預(yù)處理才能實現(xiàn)目標擴增并觸發(fā)隨后的目標識別反應(yīng)，這導(dǎo)致了低特異性和較高背景信號的缺點。最近，一些基于硫代磷酸末端發(fā)夾形成和自激延伸(ps-thsp)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(lamp)和連接酶鏈反應(yīng)(lcr)的連接依賴性核酸檢測擴增方法進入人們的視野。作為crispr系統(tǒng)構(gòu)建生物傳感器的主要機制，cas12a順式切割活性的探索仍有待開發(fā)。mangorna適配體較易設(shè)計并進行編碼改造，利用其與目標染料(to1-biotin)結(jié)合產(chǎn)生明亮的熒光信號，作為本研究的信號表征系統(tǒng)。

3、在此，我們展示了一種一鍋法順式切割熒光生物傳感器，可用于microrna的無標記檢測。通過探索連接識別觸發(fā)rpa反應(yīng)的特殊等溫擴增設(shè)計，生成含有pam序列的雙鏈dna擴增子。在cas12a順式切割系統(tǒng)中，通過調(diào)節(jié)cas12a和t7?rna聚合酶在雙鏈dna擴增子中的活性，控制系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和順式切割。此外，含有pam序列的雙鏈dna擴增子被cas12a順式切割后，會不斷轉(zhuǎn)錄出能與to1-biotin結(jié)合的功能性mango?rna，從而產(chǎn)生放大的熒光輸出信號。通過對反應(yīng)動力學(xué)的設(shè)計和條件的優(yōu)化，將連接識別、rpa、cas12a順式切割系統(tǒng)結(jié)合等多個反應(yīng)整合到一個協(xié)作耦合反應(yīng)體系中，創(chuàng)建了一種用于mirna分析的穩(wěn)健的一鍋法等溫檢測。得益于連接-識別觸發(fā)rpa的級聯(lián)放大效應(yīng)和一鍋等溫測定法，這種傳感器可在40分鐘內(nèi)實現(xiàn)靈敏檢測。此外，它還能通過特異性連接酶有效識別單堿基突變。該方法具有靈敏度高、特異性強、通用性好、無背景等優(yōu)點，在臨床mirna分析中具有很大的應(yīng)用潛力。更重要的是，連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器用于microrna一鍋法檢測技術(shù)大大簡化了檢測工作流程，無需專業(yè)儀器，為臨床診斷提供了一種高適應(yīng)性方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、1.本發(fā)明提供了一種基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割的熒光rna適配體生物傳感器用于microrna一鍋法檢測，以解決現(xiàn)有方法特異性不高、操作復(fù)雜、成本高等問題。所述方法包括：

2、(1)提供反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包括mango探針、anti-mango探針、t4dna連接酶、dna聚合酶、nebuffer?r2.1和t4?dna連接反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)混合物。其中所述的mango探針包括mango序列(黃色區(qū)域)和mirna-21特異性識別位點(藍色區(qū)域)。anti-mango探針包含用于特異性識別mirna-21的識別區(qū)域(藍色區(qū)域)、anti-mango區(qū)域(橙色區(qū)域)和crrna序列(青色區(qū)域)；

3、(2)將步驟(1)所述反應(yīng)混合物置于反應(yīng)溫度，所述的mango探針與anti-mango探針在堿基互補配對的作用下與mirna-21在目標識別位點結(jié)合形成三鏈復(fù)合物，并在t4?dna連接酶和dna聚合酶的作用下形成帶有pam位點的rpa擴增子；

4、(3)提供rpa擴增的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包括基因組正向引物、反向引物、ssb蛋白、重組酶和nebuffer?r2.1反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)混合物。其中所述的正向引物包含完整的t7啟動子序列(粉色區(qū)域)；

5、(4)將步驟(2)所述反應(yīng)混合物置于反應(yīng)溫度(3)中所述反應(yīng)混合物中，步驟(2)中所述的rpa擴增子產(chǎn)物能夠與步驟(3)中所述反應(yīng)混合物中的引物序列以及ssb蛋白的作用下識別并進一步在重組酶和dna聚合酶的作用下進行rpa擴增以得到大量帶有t7啟動子的rpa擴增子產(chǎn)物；

6、(5)提供cas12a及體外轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包括cas12a蛋白、t7rna聚合酶、rntps、rnase抑制劑、t7?rna轉(zhuǎn)錄緩沖液和nebuffer2.1反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)混合物；

7、(6)將步驟(4)所述反應(yīng)混合物置于反應(yīng)溫度(5)中所述反應(yīng)混合物中，步驟(4)中所述的大量帶有t7啟動子的rpa擴增子產(chǎn)物首先作為轉(zhuǎn)錄模板鏈與步驟(5)中所述反應(yīng)混合物中的t7?rna聚合酶結(jié)合并轉(zhuǎn)錄出anti-mango-crrna，anti-mango-crrna由于封閉的二級結(jié)構(gòu)無法to1-biotin結(jié)合，進一步地，cas12a蛋白可以對anti-mango-crrna加工形成成熟的crrna并自提供給之后的反應(yīng),帶有pam位點的rpa擴增子作為激活鏈與cas12a-crrna反應(yīng)，激活cas12a蛋白的順式切割活性并實現(xiàn)了對rpa擴增子的順式切割，最后，被順式切割的rpa擴增子再次作為t7轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄出functional?mango?rna,與to1-biotin結(jié)合，產(chǎn)生強烈的熒光輸出信號；

8、(7)分析所述擴增產(chǎn)物以識別目標堿基類型，包括實時聚丙烯酰胺凝膠電泳分析、實時熒光分析，其中在所述步驟(2)、所述步驟(4)和所述步驟(6)之前提供所述反應(yīng)混合物。

9、2.產(chǎn)生熒光rna適配體(functional?mango?rna)的轉(zhuǎn)錄過程受轉(zhuǎn)錄機制和cas12a順式切割機制的調(diào)控，mirna-21激活的t4?dna連接反應(yīng)通過rpa擴增rpa擴增子放大了信號輸出。其中所述完整rpa擴增子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的anti-mango-crrna通過對functional?mango結(jié)構(gòu)的封閉降低了反應(yīng)的背景信號。

10、3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中所述的方法，其中所述mirna-21與連接探針結(jié)合并完成t4dna連接時，dna聚合酶與mango探針的自身引物序列結(jié)合從而激活其聚合反應(yīng)形成雙鏈dna；當mirna-21從系統(tǒng)中移除時，mango探針與anti-mango探針無法發(fā)生連接反應(yīng)。與此同時，ssb蛋白和重組酶會識別并與雙鏈dna結(jié)合，dna聚合酶與帶有t7啟動子的引物結(jié)合從而激活rpa擴增。rpa擴增產(chǎn)生的rpa擴增子包含t7啟動子序列(粉色區(qū)域)、mango?rna適配體轉(zhuǎn)錄模板序列(橙色區(qū)域)、mirna-21識別區(qū)域(藍色區(qū)域)、pam位點(紫色區(qū)域)、anti-mango序列(橙紅色區(qū)域)和crrna轉(zhuǎn)錄模板序列(青色區(qū)域)。在cas12a順式切割系統(tǒng)中，通過調(diào)節(jié)cas12a和t7?rna聚合酶在雙鏈dna擴增子中的活性，將它們結(jié)合在一起。其中所述crispr/cas12a具有前crrna處理活性，可用于將完整rpa擴增子轉(zhuǎn)錄的anti-mango-crrna處理成成熟的crrna，實現(xiàn)crrna對cas12a順式切割系統(tǒng)的自我供給。其中所述含有pam序列的雙鏈dna擴增子被cas12a順式切割后，會不斷轉(zhuǎn)錄出能與to1-biotin結(jié)合的functionalmango?rna，從而產(chǎn)生熒光輸出信號。

11、4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述傳感系統(tǒng)的熒光光譜和page結(jié)果來驗證mirna-21檢測的可行性。通過分析mango探針與anti-mango探針能否識別mirna-21以及當加入t4?dna聚合酶后mango探針與anti-mango探針能否有效連接。凝膠電泳分析表明，當mango探針與anti-mango探針在不加入mirna-21的情況下，未觀察到連接條帶。當mango探針與anti-mango探針只結(jié)合mirna-21，但沒有t4?dna連接酶的情況下仍未觀察到連接條帶。只有當mango探針、anti-mango探針、t4?dna連接酶和mirna-21都存在的情況下，才能發(fā)生t4?dna連接反應(yīng)并在page分析中觀察到具有預(yù)測長度條帶。隨后，利用dna聚合酶與連接鏈的自身引物位置結(jié)合，聚合出沒有t7啟動子的rpa擴增子，并在page凝膠分析中觀察到具有預(yù)測長度的條帶。此外，我們利用rpa擴增，將帶有t7啟動子的正向引物引入rpa擴增子，并在凝膠電泳上觀察到擴增條帶。緊接著，我們利用非變性凝膠電泳分析cas12a順式切割系統(tǒng)的可行性。當帶有t7啟動子的rpa擴增子激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，在凝膠電泳中顯示到anti-mango-crrna對應(yīng)位置的條帶，緊接著，發(fā)生cas12a順式切割后的雙鏈dna轉(zhuǎn)錄出了functional?mango?rna。最后，我們將含有反應(yīng)產(chǎn)物的溶液與to1-biotin染料結(jié)合檢測熒光信號。其中所述不含mirna-21的時候熒光信號很低，而當反應(yīng)中加入mirna-21時，熒光強度增加。表明其中所述體系可以很好地發(fā)揮作用，并調(diào)控?zé)晒庑盘柕妮敵?，實現(xiàn)了七倍的熒光性配比。

12、在一些實施方式中，測量了不同反應(yīng)條件下(noncas12a、nont7-rnap?andcas12a)的熒光強度，結(jié)果與預(yù)期一致。

13、在一些實施方式中，所述進一步分析了不同時間rpa擴增對熒光強度的影響。凝膠電泳表明，在較短的時間內(nèi)rpa形成了大量的rpa擴增子。

14、5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述為了實現(xiàn)對檢測物的一鍋法檢測，提供了一種一鍋法microrna檢測體系。在三步法檢測中，其包含待測mirna-21樣本、t4dna連接和dna聚合反應(yīng)體系、rpa指數(shù)擴增反應(yīng)體系和cas12a順式切割反應(yīng)體系；其中，所述t4?dna連接和dna聚合反應(yīng)體系包括mango探針與anti-mango探針、t4?dna連接酶、dna聚合酶和mirna-21；所述rpa指數(shù)擴增反應(yīng)體系包括重組酶、ssb蛋白和dna聚合酶；所述cas12a順式切割反應(yīng)體系包括cas12a蛋白和t7?rna聚合酶；之后，在三步串聯(lián)檢測的基礎(chǔ)上，將檢測步驟囊括于一鍋法檢測中，將連接-識別系統(tǒng)、rpa系統(tǒng)和crispr順式切割反應(yīng)體系結(jié)合在一個反應(yīng)中并使用實時熒光檢測表征信號輸出。

15、在一些實施方式中，所述雖然簡化了工作流程，但這種一鍋法略微影響了檢測靈敏度和速度，這表現(xiàn)在反應(yīng)時間較長時檢測到的信號強度較低。

16、6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述為了獲得最佳一鍋法檢測性能，我們系統(tǒng)地研究并優(yōu)化了幾個重要方面。

17、在一些實施方式中，緩沖液中不同濃度的單價陽離子可能會抑制酶的活性，我們比較了兩種不同的酶緩沖液對檢測效果的影響。結(jié)果表明，nebuffer?r3.1與nebufferr2.1相比具有更高的熒光值，且兩者同時存在時效果更好可實現(xiàn)最優(yōu)的性能。

18、在一些實施方式中，所述當mg2+的濃度達到20mm時，得到了最佳的優(yōu)化信噪比，隨后趨于穩(wěn)定，因此20mm的mg2+濃度是最佳的。

19、在一些實施方式中，所述對一鍋法的反應(yīng)時間進行了優(yōu)化。當一鍋法的反應(yīng)時間達到40分鐘時，得到了最佳的優(yōu)化信噪比，隨后趨于穩(wěn)定，因此40分鐘的反應(yīng)時間是最佳的。

20、在一些實施方式中，所述反應(yīng)溫度會影響生物傳感器的響應(yīng)信號,結(jié)果顯示，37℃時的熒光強度優(yōu)于16、42和65℃時的熒光強度，因此我們將一鍋法的溫度設(shè)定為37℃。

21、在一些實施方式中，所述當cas12a蛋白的濃度為100nm時，信號最強，信噪比最好，因此100nm是最佳反應(yīng)濃度。

22、在一些實施方式中，所述當cas12a蛋白的濃度為100nm時，信號最強，信噪比最好，因此100nm是最佳反應(yīng)濃度。

23、在一些實施方式中，所述優(yōu)化了t7?rna聚合酶、dna聚合酶、t4?dna連接酶和重組酶的反應(yīng)終濃度，以獲得最佳性能。

24、7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述為了分析傳感器的性能，將其進行熒光光譜分析。

25、在一些實施方式中，所述優(yōu)化條件下，通過測量熒光信號證實了檢測的可行性。最終信號強度與mirna-21的濃度呈正相關(guān)，并隨著mirna-21濃度的增加而顯著上升。此外，在100am至100pm的濃度范圍內(nèi)，該方法具有良好的線性關(guān)系，其對應(yīng)方程為f＝244.20x-162.9(r2＝0.9943)，檢測限為3.43am，遠低于之前報道的多種mirna分析方法，這主要得益于一鍋法反應(yīng)方案的信號放大機制。

26、在一些實施方式中，所述優(yōu)化條件下，通過熒光測量和目視檢測研究了該方法的特異性。mirna長度短的一個后果是，成熟mirnas的序列非常相似。在相同的實驗條件下，與mirna-21的高熒光強度相比，mirna-155、mirna-10b、mirna-224、let-7a、let-7b和let-7c的熒光強度非常低。同樣，mirna序列的高度同源性也給精確分析帶來了困難。有效鑒定單堿基突變的microrna對臨床實際應(yīng)用具有重要意義。為了測試該方法的靈敏度，我們合成了三條非同源的microrna和另外三條同源序列作為平行對照。其中，突變體-11和突變體-12的突變位置位于交界處的兩端。然而無論堿基突變的位置在哪里，突變體組都沒有明顯的信號產(chǎn)生。此外，microrna的其他信號強度也遠低于mirna-21組。這些結(jié)果充分證明了該方法具有卓越的特異性，能有效識別單堿基突變。這些結(jié)果表明，整合lrpa-crispr檢測法在檢測mirna-21方面具有極好的特異性。

27、8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述為了評估這種方法的實際應(yīng)用，在一些實施方式中，所述使用此檢測法分析乳腺癌患者血漿樣本和細胞樣本中mirna-21的表達水平。首先用我們的方法和rt-qpcr測定了四種不同細胞系樣本中的mirna-21，包括肝細胞癌細胞(hepg2)、乳腺癌細胞系(mcf-7)、宮頸腫瘤細胞系(hela)和正常人乳腺上皮細胞(mcf-10a)。實驗結(jié)果顯示，hepg2細胞系、mcf-7細胞系和hela細胞系樣本中mirna-21的濃度明顯高于mcf-10a細胞系樣本。

28、在一些實施方式中，所述使用此檢測法分析血清樣本中的mirna-21,通過使用商品化的rna提取試劑盒從8例乳腺癌患者和8例正常健康人的血漿樣本中提取總rna，測定mirna-21，然后實時測量熒光信號。隨后，我們根據(jù)mirna濃度與熒光強度之間的關(guān)系繪制的標準曲線，估算出每個血清樣本中mirna-21的濃度，方法測得的結(jié)果與臨床標準熒光rt-qpcr技術(shù)高度一致，乳腺癌樣本的信號強度高于健康人樣本。

29、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器用于microrna一鍋法檢測具有以下優(yōu)勢：

30、(1)本發(fā)明所述的基于一鍋法檢測方案大大簡化了操作和設(shè)計過程，反應(yīng)所需時間短，操作簡單。

31、(2)本發(fā)明所述的基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器的rpa信號擴增策略可實現(xiàn)對mirna-21的靈敏檢測，檢測限為3.43am。

32、(3)本發(fā)明所述的本發(fā)明所述的基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器，通過特異性t4-dna連接酶可有效區(qū)分單堿基突變的同源序列,可實現(xiàn)對microrna的特異性檢測。

33、(4)本發(fā)明所述的一種基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感器無需熒光標記，降低了成本。

34、(5)本發(fā)明所述的一種基于連接識別rpa擴增及cas12a順式切割熒光rna適配體生物傳感不僅在復(fù)雜樣本中具有出色的穩(wěn)定性，還能成功分析腫瘤細胞和臨床患者血清樣本中的mirna-21。利用一鍋法方式，該方法可以成為簡單快速的mirna傳感器的有效策略，并在研究和臨床中得到廣泛應(yīng)用。