本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法與培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、頭頸部腫瘤是一類高侵襲性實(shí)體腫瘤，每年死亡人數(shù)約35萬(wàn)，5年病死率約為50％。其中90％是鱗狀細(xì)胞癌，是一種免疫抑制性腫瘤，為全球排名第6常見(jiàn)的癌癥。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，目前多采用包括手術(shù)、化療和放療在內(nèi)的綜合性治療。盡管在這些領(lǐng)域取得了明顯進(jìn)展，但頭頸部腫瘤患者的5年總生存率仍在50％左右。

2、惡性腫瘤是由多種類型細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、免疫炎性細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、腫瘤基質(zhì)中的干細(xì)胞和祖細(xì)胞等組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它們可創(chuàng)造出不斷演變的免疫抑制微環(huán)境，受多種細(xì)胞、激素和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

3、近年來(lái)，通過(guò)抑制檢查點(diǎn)分子進(jìn)行免疫治療已成為成功治療頭頸部腫瘤的重要組成部分，使部分腫瘤患者臨床顯著獲益，然而適用的患者仍十分有限，最主要原因是患者可能存在對(duì)免疫治療先天性耐藥。并且，傳統(tǒng)的用于腫瘤研究的臨床前模型往往無(wú)法真實(shí)反映復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境，更無(wú)法反應(yīng)腫瘤細(xì)胞與其他腫瘤相關(guān)免疫成分間的相互作用，故而相關(guān)免疫治療藥物敏感性檢測(cè)的體外實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性及臨床轉(zhuǎn)化率較低，尤其是對(duì)于免疫治療應(yīng)答率較低的頭頸部惡性腫瘤中，目前仍沒(méi)有一種能夠穩(wěn)定、可靠用于免疫治療藥物研究、預(yù)測(cè)的臨床前模型。

4、因此，建立新的真實(shí)模擬人體頭頸部腫瘤免疫微環(huán)境的臨床前模型用于腫瘤免疫的基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究顯得十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的無(wú)法還原頭頸部惡性腫瘤微環(huán)境，保留腫瘤同源性的免疫因素等技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法與培養(yǎng)基，能夠保留原始頭頸部惡性腫瘤的基質(zhì)、t細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及多種綜合免疫元素，能夠有效還原頭頸部惡性腫瘤的復(fù)雜微環(huán)境。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明的其中一個(gè)目的是提供一種重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法基于氣液界面雙碟培養(yǎng)系統(tǒng)，所述氣液界面雙碟培養(yǎng)系統(tǒng)包括外室和設(shè)于外室內(nèi)部的內(nèi)室，所述外室為無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，內(nèi)室為底部為親水性滲透膜的內(nèi)部插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，內(nèi)室內(nèi)徑小于外室內(nèi)徑，所述重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法具體步驟如下：

3、s1、將重構(gòu)膠原蛋白溶液加入內(nèi)室，待凝固后在氣液界面雙碟培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)室中形成無(wú)腫瘤組織的底層凝膠層；

4、s2、對(duì)獲得的頭頸部惡性腫瘤組織進(jìn)行處理，采用重構(gòu)膠原蛋白溶液進(jìn)行重懸，獲得包含腫瘤組織的膠原蛋白凝膠；

5、s3、向底層凝膠層中加入包含腫瘤組織的膠原蛋白凝膠，凝固后得到上層組織凝膠層；

6、s4、進(jìn)行腫瘤類器官的培養(yǎng)，在外室中放入氣液界面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基液面高度淹沒(méi)底層凝膠層，并與上層組織凝膠層的下界面接觸且不能沒(méi)過(guò)上層組織凝膠層，以形成氣液界面，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37℃，二氧化碳體積濃度5％，每周更換2次培養(yǎng)基；

7、s5、培養(yǎng)14-30天并經(jīng)過(guò)傳代后，得到頭頸部惡性腫瘤類器官體系，所述頭頸部惡性腫瘤類器官體系包括頭頸部惡性腫瘤類器官、t細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。

8、作為優(yōu)選，所述步驟s1中重構(gòu)膠原蛋白溶液的制備方法如下：通過(guò)在冰上以體積比為8:1:1的比例混合膠原蛋白基質(zhì)、10×的濃縮無(wú)菌培養(yǎng)基和無(wú)菌重組緩沖液，先將膠原蛋白基質(zhì)和10×的濃縮無(wú)菌培養(yǎng)基混勻后再加入無(wú)菌重組緩沖液再次混勻，防止產(chǎn)生氣泡，使用需置于冰上以防止形成凝膠。

9、作為優(yōu)選，所述步驟s1中將重構(gòu)膠原蛋白溶液加入內(nèi)室后，在37℃環(huán)境下放置30min，待凝固后得到底層凝膠層；所述步驟s3中加入包含腫瘤組織的膠原蛋白凝膠后，在37℃環(huán)境下放置30min，得到上層組織凝膠層；步驟s1中取的重構(gòu)膠原蛋白溶液和步驟s2中進(jìn)行重懸的重構(gòu)膠原蛋白溶液的體積比為1:1。

10、作為優(yōu)選，所述步驟s2中頭頸部惡性腫瘤組織來(lái)源包括并不限于鱗狀上皮來(lái)源惡性腫瘤(鱗狀細(xì)胞癌)和腺上皮來(lái)源惡性腫瘤(腺樣囊性癌或?qū)Ч馨?，處理步驟包括切取、浸泡、剪切、洗滌步驟。

11、作為優(yōu)選，所述預(yù)處理步驟具體為：將新鮮腫瘤標(biāo)本切取后在置于取材液中浸泡，取材液為含有20x青霉素-鏈霉素-兩性霉素溶液的dmem培養(yǎng)基(南京凱基生物科技)，用dpbs浸洗2遍，然后在含有normocin的advance?dmem/f12培養(yǎng)基中、冰上切碎，切碎后的腫瘤組織應(yīng)小于0.3mm3，然后在1500rpm、4℃、5min的條件下低溫離心；再加入含有normocin的admem/f12重懸洗滌，再次在1500rpm、4℃、5min的條件下低溫離心，洗滌操作重復(fù)2遍，得到處理后的頭頸部惡性腫瘤組織。

12、作為優(yōu)選，所述底部為親水性滲透膜的內(nèi)部插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，親水性滲透膜為孔徑為0.4μm親水性多孔ptfe膜。

13、作為優(yōu)選，所述步驟s5中傳代具體如下：將內(nèi)室中組織凝膠層轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿，剪碎組織凝膠層，向無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入解離液，轉(zhuǎn)移至離心管，在37℃下解離30min，每10min震蕩一次，然后在1500rpm、4℃、5min的條件下低溫離心，棄上清；加入含10％血清的dmem培養(yǎng)基，充分吹勻，再次在1500rpm、4℃、5min的條件下低溫離心，棄上清，重復(fù)3次，然后進(jìn)行1:2傳代。

14、所述解離液用200units/ml的iv型膠原酶和10ug/ml的dnaseⅰ以無(wú)血清的dmem為溶劑配制。

15、本發(fā)明的第二個(gè)目的為提供一種上述一種重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法的頭頸部惡性腫瘤類器官氣液界面培養(yǎng)基，所述頭頸部惡性腫瘤類器官氣液界面培養(yǎng)基的組成如下：advanced?dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、glutamax添加劑、hepes、pen-strep?glutamine、煙酰胺、n-acetylcysteine、b27、p38mapk抑制劑sb202190、a8301、r-spondin1重組蛋白、noggin蛋白、egf、gasrtin?i、wnt?3a、il-2，其中g(shù)lutamax添加劑的濃度為1×、hepes的濃度為10mmol/l、n-乙酰半胱氨酸的濃度為1mmol/l、煙酰胺的濃度為10mmol/l、pen-strep?glutamine的濃度為1×、b27的濃度為1×、p38mapk抑制劑sb202190的濃度為10umol/l、a8301的濃度為0.5umol/l、r-spondin1重組蛋白的濃度為0.05-0.25ug/ml、重組human?noggin蛋白的濃度為0.05-0.2ug/ml、egf的濃度為50ng/ml、gastrin?i的濃度為10nmol/l、human?wnt-3a的濃度為0.05-0.2ug/ml、il-2的濃度為500iu/ml，advanced?dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充至所需體積50ml。

16、本發(fā)明的第三個(gè)目的為提供一種基于上述一種重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法制備的頭頸部惡性腫瘤類器官在篩選治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

17、氣液界面雙碟培養(yǎng)系統(tǒng)是一種特殊的腫瘤類器官培養(yǎng)模型，相較于共培養(yǎng)模式在評(píng)估腫瘤微環(huán)境方面的不足，在這個(gè)系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)形成類器官，保留了原腫瘤的病理特征和遺傳改變。腫瘤組織的免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞基質(zhì)可維持一定時(shí)間，更好地模擬腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，該方法為體外免疫tme建模提供了一種整體策略，可以探索多個(gè)不同細(xì)胞群體之間的復(fù)雜串?dāng)_。

18、有益效果：(1)本發(fā)明的重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法，能夠保留具有原始腫瘤的成纖維基質(zhì)及多種綜合免疫元素，能夠有效還原復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，作為頭頸部惡性腫瘤患者精準(zhǔn)醫(yī)療的藥物篩查平臺(tái)例如腫瘤靶向藥，相較于其他體外模型更具可靠性；也可作為研究腫瘤微環(huán)境中各組分之間相互作用的體外模型平臺(tái)。

19、(2)本發(fā)明的重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法，得到的類器官含有天然同源、自體腫瘤反應(yīng)性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，可以直接模擬體內(nèi)腫瘤免疫微環(huán)境，而不需要額外添加t細(xì)胞進(jìn)行類器官的共培養(yǎng)，并且通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證該頭頸部惡性腫瘤類器官體系能夠在體外較長(zhǎng)時(shí)間維持腫瘤同源性的t細(xì)胞等腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，可后續(xù)用于個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療，作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感性的藥物篩查平臺(tái)。

20、(3)本發(fā)明的重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法，由于采用單純機(jī)械方法破碎腫瘤，而未采用酶消法消化腫瘤組織成單個(gè)細(xì)胞或破碎至勻漿狀，從而使得腫瘤細(xì)胞活性得以最大程度保留，可以使臨床上放、化療后難以采用基質(zhì)膠法構(gòu)建類器官的個(gè)例也能夠在體外培養(yǎng)出臨床前類器官藥敏模型。

21、(4)本發(fā)明的重建腫瘤微環(huán)境的頭頸部惡性腫瘤類器官培養(yǎng)方法，采用重組膠原蛋白凝膠，其中cellmatrix?type?i-a可更快地重組堅(jiān)硬且一致性高的凝膠，使得類器官在沉底之前即被固定在凝膠中，更易維持三維生長(zhǎng)；細(xì)胞和類器官在凝膠中能成長(zhǎng)發(fā)育，培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性高；使用凝膠培養(yǎng)的細(xì)胞可在與在體內(nèi)相似的三維形態(tài)中增殖，避免了matrigel不同批次之間的差異性造成的類器官培養(yǎng)的不穩(wěn)定性。

22、(5)本發(fā)明的培養(yǎng)基針對(duì)于頜面部惡性腫瘤以及腫瘤微環(huán)境中的組分的培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn)選用了多種細(xì)胞因子成份，將其按照特定的比例進(jìn)行復(fù)配，使所獲得的培養(yǎng)基中含有適宜含量的細(xì)胞因子、信號(hào)通路調(diào)控因子，各種細(xì)胞因子及調(diào)控因子相互直接密切影響，協(xié)調(diào)配合，提高活細(xì)胞的比例，從而加快類器官的擴(kuò)增，縮短培養(yǎng)的時(shí)間，讓氣液界面法培養(yǎng)的類器官能夠維持與原始腫瘤相同的組織形態(tài)和特性；同時(shí)均選用商品化產(chǎn)品，避免了傳統(tǒng)腫瘤類器官培養(yǎng)所帶來(lái)的成分誤差。