本發(fā)明涉及核酸測(cè)序、核酸序列及表觀遺傳修飾檢測(cè)，特別涉及一種基于自校準(zhǔn)熒光的焦磷酸測(cè)序、qpcr及等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、當(dāng)前，基于生物標(biāo)志物的液體活檢因其無(wú)創(chuàng)、方便的標(biāo)本采集和強(qiáng)大的監(jiān)測(cè)能力等優(yōu)點(diǎn)，已成為腫瘤診斷的研究熱點(diǎn)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。其中，最為重要的生物標(biāo)志物就是循環(huán)總游離dna和rna(cfdna和cfrna)，它具有極高臨床診斷價(jià)值。當(dāng)前主流的診斷方法可以分為兩類(lèi)：一是dna/rna含量分析，指對(duì)某一段特定核酸突變序列或某種特定的表觀遺傳修飾(5fc等)進(jìn)行含量監(jiān)測(cè)，以反映疾病進(jìn)展，這類(lèi)分析的代表性金標(biāo)準(zhǔn)方法為qpcr；二是對(duì)核酸序列進(jìn)行測(cè)序分析，精準(zhǔn)分析全基因組中序列的變化或者表觀遺傳修飾變化，從而更深入地理解疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，為治療決策提供指導(dǎo)，這類(lèi)分析的代表性方法有焦磷酸測(cè)序、納米孔測(cè)序等。

2、然而，最新的研究表明，無(wú)論是qpcr含量分析，還是基于各類(lèi)測(cè)序方法的核酸序列分析，都存在一個(gè)共有難題，即缺乏自校正帶來(lái)的分析精準(zhǔn)度低，這嚴(yán)重限制了這些方法在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。因此，追求創(chuàng)新的核酸檢測(cè)方法變得勢(shì)在必行，以提高核酸分析在生物標(biāo)志物評(píng)估和分子診斷方面的精密度和準(zhǔn)確性。我們關(guān)注到，焦磷酸鹽(ppi)作為核酸擴(kuò)增過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵產(chǎn)物，其含量分析有望被擴(kuò)展到精準(zhǔn)量化核酸靶點(diǎn)的含量，包括dna/rna序列突變和表觀遺傳學(xué)修飾等。而關(guān)鍵的難題在于，如何開(kāi)發(fā)能夠精準(zhǔn)分析ppi含量的新方法，并將其用于各位核酸的含量及序列分析中。

3、因此，為了實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、靈敏和高選擇性的ppi分析及核酸檢測(cè)，有必要開(kāi)發(fā)一種核酸的焦磷酸測(cè)序、qpcr及等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的試劑盒和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種鑭系mof材料在制備熒光焦磷酸測(cè)序或核酸檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，本技術(shù)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)鑭系mof具有熒光壽命長(zhǎng)、具備多發(fā)光中心，能夠基于ppi自校正傳感實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)核酸檢測(cè)的性能，鑭系mof對(duì)各類(lèi)生物樣本(血液、血漿、血清、尿液等)中dna/rna均可實(shí)現(xiàn)序列分析以及含量檢測(cè)，其精準(zhǔn)度高、靈敏度高，應(yīng)用范圍廣且成本低。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、在本發(fā)明的第一方面，提供了鑭系mof材料在制備熒光焦磷酸測(cè)序或核酸檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步地，所述核酸檢測(cè)試劑盒包括qpcr檢測(cè)試劑盒和等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)檢測(cè)試劑盒中的一種；所述鑭系mof材料包括：la-mof、ce-mof、pr-mof、nd-mof、pm-mof、sm-mof、eu-mof、gd-mof、tb-mof、dy-mof、ho-mof、er-mof、tm-mof、yb-mof、lu-mof中的至少一種，每一種鑭系mof均具備各自鑭系離子的特征性長(zhǎng)壽命發(fā)光，且同一種鑭系mof中可能同時(shí)存在兩種及兩種以上的鑭系離子，例如ceeu-mof，cetb-mof，eutb-mof等。

5、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于dna/rna熒光檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括：鑭系mof材料和熒光檢測(cè)所需試劑。

6、進(jìn)一步地，所述熒光檢測(cè)包括核酸qpcr檢測(cè)、核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)、焦磷酸測(cè)序檢測(cè)中的一種，所述核酸qpcr檢測(cè)所需試劑包括：dna引物、dna模板、dna聚合酶以及擴(kuò)增底物dntps；所述核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)所需試劑包括dna模板、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶tdt酶以及擴(kuò)增底物dntps；所述焦磷酸測(cè)序檢測(cè)所需試劑包括dna模板、測(cè)序引物、測(cè)序所需的dntps以及雙發(fā)射鑭系mof。

7、進(jìn)一步地，所述鑭系mof材料的終濃度為10-1000μg/ml。

8、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于dna/rna熒光焦磷酸測(cè)序的方法，所述方法包括：

9、對(duì)細(xì)胞、組織或體液樣品進(jìn)行預(yù)處理以使得dna/rna恢復(fù)游離狀態(tài)，獲得處理后的樣品溶液；

10、采用任意一種核酸提取試劑提取并純化所述處理后的樣品溶液中的dna/rna；

11、對(duì)所述純化后的溶液進(jìn)行無(wú)標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)，獲得測(cè)序結(jié)果。

12、進(jìn)一步地，所述體液樣品包括全血、血漿、血清、尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液、膽汁、淋巴液、腹水中的至少一種。

13、所述鑭系mof自校正熒光焦磷酸測(cè)序方法，避免了避免了經(jīng)典的生物發(fā)光焦磷酸測(cè)序方法中atp硫酸化酶、熒光素酶、底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐(aps)和熒光素的使用。

14、進(jìn)一步地，所述鑭系mof材料的添加終濃度為5～500μg/ml。

15、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于dna/rna的qpcr檢測(cè)的方法，所述方法包括：

16、制備qpcr反應(yīng)體系進(jìn)行qpcr反應(yīng)；qpcr反應(yīng)結(jié)束后加入鑭系mof，采用熒光分光光度計(jì)分析鑭系mof的系列熒光，構(gòu)建鑭系mof的熒光標(biāo)曲，借助熒光標(biāo)曲計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

17、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種用于dna/rna的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的方法，所述方法包括：

18、使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在含有dntp的反應(yīng)體系中，對(duì)核酸模板的3'末端進(jìn)行延伸；反應(yīng)完成后加入鑭系mof以終止反應(yīng)，并通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行分析，構(gòu)建鑭系mof的熒光標(biāo)曲，借助熒光標(biāo)曲計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

19、本發(fā)明實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

20、本發(fā)明提供一種鑭系mof材料在制備核酸的熒光檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，從各類(lèi)生物樣本中提取得到dna/rna后，基于發(fā)光鑭系mof可以實(shí)現(xiàn)多維度核酸信息分析，包括核酸序列分析(采用所開(kāi)發(fā)的鑭系mof焦磷酸測(cè)序方法)、核酸豐度分析(采用所開(kāi)發(fā)的基于鑭系mof的qpcr方法)以及核酸等溫?cái)U(kuò)增分析(采用tdt酶輔助的等溫?cái)U(kuò)增-鑭系mof熒光分析方法)。以上多維度信息方法實(shí)現(xiàn)的前提是基于鑭系mof對(duì)于ppi具有優(yōu)異的的自校正熒光傳感性能。具體原因在于：首先，鑭系離子對(duì)于ppi的親和力極高，有利于傳感的高靈敏度；其次，鑭系mof具備多發(fā)光中心，可以實(shí)現(xiàn)單樣本多通道熒光自校正分析；最后，經(jīng)過(guò)配體工程合理設(shè)計(jì)制備的鑭系mof，其發(fā)光性質(zhì)可以被ppi進(jìn)行熒光開(kāi)啟調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、靈敏定量。具體優(yōu)點(diǎn)如下：

21、(1)對(duì)于焦磷酸測(cè)序方法的重要改進(jìn)：一方面，鑭系mof材料具備長(zhǎng)壽命熒光，熒光信號(hào)不易受到背景干擾，且熒光耐受光漂白，這是熒光精準(zhǔn)定量的前提；另一方面，多發(fā)射鑭系mof對(duì)于焦磷酸的響應(yīng)存在差異，這產(chǎn)生了熒光自校準(zhǔn)功能，保證了焦磷酸測(cè)序信號(hào)的高精密度、高準(zhǔn)確度和高靈敏度；更重要的是，傳統(tǒng)的焦磷酸測(cè)序方法需要使用atp硫酸化酶和熒光素酶等酶，并且依賴(lài)于底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐(aps)和熒光素。這些組分的使用不僅增加了實(shí)驗(yàn)成本，還可能影響測(cè)序的精度和穩(wěn)定性。本發(fā)明通過(guò)引入鑭系mof，實(shí)現(xiàn)了自校準(zhǔn)、長(zhǎng)壽命熒光檢測(cè)，從而改進(jìn)了經(jīng)典的焦磷酸測(cè)序方法，提高了測(cè)序數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)度，同時(shí)具備了科技進(jìn)步性和經(jīng)濟(jì)效益。

22、(2)對(duì)于dna/rna的qpcr分析應(yīng)用，本方法的重要改進(jìn)：無(wú)需商品化合成復(fù)雜、春純化成本高的核酸熒光染料，本方法采用發(fā)光鑭系mof替代了qpcr中的關(guān)鍵熒光燃料，具體帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)包括但不限于制備純化簡(jiǎn)單、成本低、熒光耐受光漂白、具備雙發(fā)射熒光自校準(zhǔn)功能，核酸擴(kuò)增過(guò)程中無(wú)需高溫破壞聚合酶即可快速終止反應(yīng)，進(jìn)而原位熒光定量分析。

23、(3)對(duì)于核酸的無(wú)標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)，重要的改進(jìn)在于將等溫?cái)U(kuò)增方法擴(kuò)展到新的應(yīng)用場(chǎng)景，即dna表觀遺傳修飾的簡(jiǎn)便、高靈敏、精準(zhǔn)定量分析：在特定dna表觀遺傳修飾進(jìn)行生物素化修飾后，即可采用鏈霉親和素磁珠進(jìn)行富集，進(jìn)而使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt酶)進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，從而對(duì)極低豐度的dna表觀修飾(5hmc、5fc、5cac等)進(jìn)行精準(zhǔn)定量。

24、(4)本發(fā)明的方法不僅可以對(duì)各種類(lèi)型的血液(包括全血，血漿和血清)中的循環(huán)游離核酸進(jìn)行測(cè)序或擴(kuò)增定量分析，同樣可以適用于其他各種類(lèi)型的體液中的循環(huán)游離核酸的富集，包括但不局限于尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液、膽汁、淋巴液、腹水等。這主要得益于如前所述的鑭系mof的長(zhǎng)壽命熒光，可以不受生物背景熒光的干擾，因此對(duì)于各類(lèi)樣本的耐受度更高。