本發(fā)明屬于環(huán)境微生物，具體涉及一種降解二甲苯的微生物混合菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、二甲苯(xylene)是一種常見的有機溶劑，廣泛用于化工、油漆、橡膠和皮革等行業(yè)。然而，二甲苯具有較強的毒性和揮發(fā)性，對環(huán)境和人類健康造成了嚴重威脅。長期暴露于二甲苯環(huán)境中可能導致神經(jīng)系統(tǒng)損害、肝腎功能異常以及呼吸系統(tǒng)疾病。因此，尋找高效、環(huán)保的二甲苯降解方法顯得尤為重要。

2、目前，處理二甲苯污染的方法主要包括物理、化學和生物降解法。物理方法如吸附和膜分離雖然能夠去除部分二甲苯，但存在處理成本高、易產(chǎn)生二次污染等問題?；瘜W方法如氧化和還原反應(yīng)雖然反應(yīng)速度快，但同樣存在試劑消耗大、操作復雜等不足。

3、相比之下，生物降解法因其環(huán)保、成本低、無二次污染等優(yōu)點，逐漸受到重視。生物降解法利用微生物的代謝活動將二甲苯轉(zhuǎn)化為無毒或低毒物質(zhì)，從而達到凈化環(huán)境的目的。許多過往的研究表明，一些天然存在的微生物具有降解二甲苯的能力，尤其是假單胞菌屬應(yīng)用甚多，例如k.sarayu等設(shè)計生物接觸反應(yīng)器處理含有甲苯和二甲苯的廢水時，其中的生物膜上的微生物就包括假單胞菌屬(pseudomonas?sp.)。l.d.collins等對分配生物反應(yīng)器的方案中亦使用菌株pseudomonas?sp.atcc?55595，該菌株能同時降解苯、甲苯和對二甲苯。專利cn105087429a從受工業(yè)污染的土壤中分離出一種能降解鄰二甲苯的假單胞菌pseudomonas.sp.ox5，該菌株對濃度為1500mg/l的鄰二甲苯降解率可達80％；專利cn117402774a公布了一種能降解包括二甲苯在內(nèi)的各種單環(huán)芳香烴化合物的假單胞菌pseudomonas?sp.bo3-4，但該菌株對二甲苯的降解率僅為30％。假單胞菌屬在降解芳香族化合物的污染上已經(jīng)得到充分的利用。

4、除此之外，you等分離的紅球菌屬rhodococcus?sp.zjut312對苯系物具有良好的降解率和較大的底物范圍，能夠適應(yīng)500mg/l的環(huán)境，培養(yǎng)100h對鄰二甲苯的降解率高達0.117mmol?l-1h-1；euisoon?jeong等從廢水處理廠的活性污泥中分離出來的紅球菌屬的rhodococcus?sp.bto62能夠降解各種苯系物，且在高負荷的生物滴濾器中接種7d，對鄰二甲苯的降解效率能保持在90％以上。專利cn?113151053?a從垃圾滲濾液中分離出一株能降解各種苯系物的克雷伯氏菌屬(klebsiella?sp.)下的佛里德蘭德氏桿菌(klebsiellapneumoniae)，并且在5mg/l的對二甲苯溶液中培養(yǎng)48h降解率高達100％；專利cn117327613a公布了一種苯系物降解菌食醚紅球菌(rhodococcus?aetherivorans)，48h培養(yǎng)下對100mg/l的甲苯、乙苯和二甲苯的降解率均達到95％以上。這說明除假單胞菌屬外還有更多能降解苯系物的菌屬存在，但是單一菌株通常難以應(yīng)對復雜的污染環(huán)境。

5、為了解決這一問題，科學家們開始研究混合菌劑的應(yīng)用?；旌暇鷦┯啥喾N微生物組成，各菌株之間可以通過代謝互補提高整體降解效率。此外，混合菌劑還具有適應(yīng)性強、抗逆性好等優(yōu)點，能夠在多變的環(huán)境條件下穩(wěn)定發(fā)揮作用。

6、然而目前市場上缺乏高效的二甲苯降解混合菌劑，專利cn110591984b以短單胞桿菌(brachymonas?sp.)lm-r和拜葉林克氏菌(beijerinckiacase?sp.)lm-w制備的混合菌劑可降解甲苯、二甲苯與丙烯酸的混合廢水，在1000mg/l的環(huán)境下各底物降解率能達到99.99％。另外上述研究中的菌株多來自于工業(yè)用地的土壤水體等，其他環(huán)境中的二甲苯降解的菌株鮮有研究。針對這一現(xiàn)狀，本發(fā)明從廚余垃圾中提取了兩株二甲苯降解菌，配置了一種新型的降解二甲苯的混合菌劑，并介紹了其制備方法和應(yīng)用。該混合菌劑通過科學的菌種篩選和優(yōu)化組合，顯著提高了二甲苯的降解效率，為二甲苯污染的生物修復提供了新的解決方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對上述問題提供了一種降解二甲苯的復合菌劑及其制備方法和應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)高效降解二甲苯的目的。

2、為達到上述目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種降解二甲苯的微生物混合菌劑，包括池生代爾福特菌m2菌株的菌液和保護假單胞菌m9菌株的菌液。

4、本發(fā)明所述m2菌株經(jīng)形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定和基因組測序比對與代爾夫特菌屬，池生代爾夫特菌的相似度為99.86％，可認定為池生代爾夫特菌。所述m9菌株經(jīng)形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定和基因組測序比對與假單胞菌屬，保護假單胞菌的相似度為100％，可認定為保護假單胞菌。

5、進一步，所述生代爾福特菌m2菌株的菌液和保護假單胞菌m9菌株的菌液的體積比為1:1或1:3。

6、進一步，所述生代爾福特菌m2菌株的菌液的od600為0.455±0.005，所述保護假單胞菌m9菌株的菌液的od600為0.455±0.005。

7、進一步，所述生代爾福特菌m2菌株和保護假單胞菌m9菌株均分離自肉骨垃圾，其16s?rdna的核苷酸序列分別如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示。

8、第二方面，本發(fā)明提供了一種降解二甲苯的微生物混合菌劑的制備方法，包括以下步驟：

9、步驟1，培養(yǎng)池生代爾福特菌m2菌株的菌液：按照10％的接種量(體積比)將池生代爾福特菌m2菌株接種于lb液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min培養(yǎng)3天，獲得池生代爾夫特菌m2菌株的菌液；

10、步驟2，培養(yǎng)保護假單胞菌m9菌株的菌液：按照10％的接種量將保護假單胞菌m9菌株接種于lb液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min培養(yǎng)3天，獲得保護假單胞菌m9菌株的菌液；

11、步驟3，分別用lb液體培養(yǎng)基將池生代爾福特菌m2菌株和保護假單胞菌m9菌株的菌液的od600調(diào)整為0.455±0.005，確保單菌液中菌的濃度一致；

12、步驟4，將步驟3中所得菌濃度一致的單菌液按比例混合，即得到微生物混合菌劑。

13、第三方面，本發(fā)明提供了一種降解二甲苯的微生物混合菌劑的應(yīng)用，用于降解環(huán)境中的二甲苯。

14、進一步，所述環(huán)境為水體。

15、進一步，所述應(yīng)用的方法為：將菌劑接種于含有二甲苯的水體中，接種量為10％，適用溫度為30℃。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

17、本發(fā)明對分離得到的可顯著降低二甲苯濃度的兩種菌進行不同比例組合，通過底物法對lb培養(yǎng)基中的二甲苯進行顯著性分析，進而分析不同比例組合對其降解情況，從而確定對二甲苯降解的最優(yōu)比例組合。這對于豐富降解芳香烴化合物的微生物群，開發(fā)高效穩(wěn)定的微生物菌劑具有重要意義。

18、本發(fā)明提供的具有二甲苯降解能力的池生代爾福特菌m2菌株和保護假單胞菌m9菌株是以廚余垃圾中的肉骨垃圾為菌源分離得到的，不會對周圍環(huán)境和生態(tài)平衡造成危害。通過在加入二甲苯的lb培養(yǎng)基中的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，m2菌株、m9菌株及m2和m9不同比例復配的菌劑均具有較好降解二甲苯的能力，且復配菌劑去除效果更好，作用時間更短。該復合菌劑能夠應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境修復，可降解水體中的二甲苯，豐富了降解芳香族化合物的微生物體系，對開發(fā)高效穩(wěn)定的微生物菌劑具有重要意義。