：本發(fā)明涉及分子診斷，具體涉及一種作為診斷主動(dòng)脈瓣鈣化標(biāo)志物的血漿外泌體circrna的組合。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、鈣化主動(dòng)脈瓣疾病(calcific?aortic?valve?disease，cavd)是一種高發(fā)病率和高死亡率的老年性進(jìn)行性疾病，主要病理生理改變?yōu)橹鲃?dòng)脈瓣瓣葉纖維增生鈣化從而導(dǎo)致瓣膜變硬并引起血流動(dòng)力學(xué)改變，從而影響心臟功能。以往觀點(diǎn)均認(rèn)為cavd是一種與年齡相關(guān)的退行性病變，是隨著年齡增長，瓣膜組織的退化硬化過程。目前，cavd缺乏有效的臨床可用藥物治療方案，其主要治療手段為主動(dòng)脈瓣置換手術(shù)。然而，接受外科手術(shù)的患者必然會(huì)承擔(dān)較高的醫(yī)療手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，了解cavd的分子機(jī)制并尋找新的分子生物標(biāo)記對(duì)于改善該病的診斷，實(shí)現(xiàn)疾病早期預(yù)防早期干預(yù)至關(guān)重要。

2、外泌體是直徑為40-100nm的納米級(jí)雙層膜囊泡，廣泛分布于血液，唾液，尿液和其他體液中。外泌體可以攜蛋白質(zhì)，脂質(zhì)體，非編碼rna及mrna等到達(dá)靶組織，通過參與細(xì)胞間交互，調(diào)控腫瘤，免疫及心血管疾病。

3、環(huán)狀rna(circrna)是一類通過反向剪接前體rna(pre-mrna)形成共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)的非編碼rna。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中富含穩(wěn)定circrna。circrna因具有保守性，通用性，穩(wěn)定性和組織或發(fā)育階段特異性等重要特性。已有大量的研究表明環(huán)狀rna在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中扮演重要角色，其上述特點(diǎn)使得circrna在作為臨床疾病理想診斷標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有了非常廣闊的前景。

4、與血液中游離rna相比，外泌體衍生的rna作為生物標(biāo)記具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)。一方面，外泌體膜有效保護(hù)內(nèi)含物免受rnase降解，從而保持其完整性和功能性。另一方面，circrna穩(wěn)定且在血液、唾液及外泌體中穩(wěn)定豐富表達(dá)，是主動(dòng)脈瓣鈣化早期診斷、預(yù)防和早期干預(yù)的可靠指標(biāo)。人血清外泌體富含完整且穩(wěn)定的circrna，其作為主動(dòng)脈瓣鈣化早期診斷的生物標(biāo)志物潛力巨大?，F(xiàn)有技術(shù)中公布號(hào)為cn113667733a的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種circrna在主動(dòng)脈瓣鈣化的診斷試劑盒及治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用，在該發(fā)明中，與正常主動(dòng)脈瓣組織相比，鈣化主動(dòng)脈瓣組織中的circrnaprdm5顯著上調(diào)，也可作為制備治療主動(dòng)脈瓣鈣化藥物的靶基因。雖然該專利公開的技術(shù)方案能夠用于藥物開發(fā)和診斷，但并未明確其作為主動(dòng)脈瓣鈣化的分子標(biāo)志物的診斷價(jià)值，且其circrna來源于瓣膜組織而非血漿外泌體，不適用于主動(dòng)脈瓣鈣化的臨床早期診斷。因此，提出一種外泌體circrna作為診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用來解決上述問題很有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對(duì)上述背景，本發(fā)明提出外泌體circrna作為診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的分子標(biāo)志物，可以應(yīng)用于主動(dòng)脈瓣鈣化的臨床早期診斷，已解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏有效的主動(dòng)脈瓣鈣化早期診斷手段的問題。

3、(二)技術(shù)方案

4、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

5、外泌體circrna作為診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的分子標(biāo)志物的應(yīng)用，所述外泌體circrna為外泌體hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642中任一種，所述分子標(biāo)志物為外泌體hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642中任一種或兩種以上的分子標(biāo)志物組合，所述外泌體為血漿外泌體，所述外泌體的核苷酸序列如seq?id?no:1-6所示，具體如下，

6、所述外泌體hsa_circ_0087765在基因組上的定位為

7、chr9:100308499-100310379，環(huán)化序列長度為263個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:1所示，具體為：

8、gcagtttttcacagtttattggttattcctgcccgaagtcagaactttgacatcttgcaaagtgccat

9、cagtaagcatttggttgggttgactgtaattcctgacagcacggctggctgtgtttttggtgttatct

10、gtaagctcctggatcatacttgtgtagttagtgagactctactgccatttctggcttcttgttgctacagtcttctttattttctgctcactatagagaaaggggaagcagaacatctaagaaagag；

11、所述外泌體hsa_circ_0062397在基因組上的定位為

12、chr22:20824325-20838731，環(huán)化序列長度為300個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:2所示，具體為：

13、gtccaaaagcttctttgcatgtgtccagtggatttccatgggatcttccagttagatgaaagacggag

14、agatgcagtgattgcattgggcatttttctgattgaatctgatcttcagcacaaagattgtgtggttc

15、cttaccttcttcgacttctcaaaggtcttccaaaagtgtattgggtagaagaaagcacagctcggaaa

16、ggcagaggtgccctcccggttgcagagagcttcagcttctgcttggtaactctgctgtctgatgtggcctatagggatccttcacttagggatgag；

17、所述外泌體hsa_circ_0000098在基因組上的定位為

18、chr1:100906851-100921841，環(huán)化序列長度為660個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:3所示，具體為：

19、cttaggcttgatttccgactcttttcacatgtttttcgatagcactgccattttggctggactggcagcttctgttatttcaaaatggagagataatgatgctttctcctatgggtatgttagagcggaagttctggctggctttgtcaatggcctatttttgatcttcactgctttttttattttctcagaaggagttgagagagcattagcccctccagatgtccaccatgagagactgcttcttgtttccattcttgggtttgtggtaaacctaataggaatatttgttttcaaacatggaggtcatggacattctcatggctctggccacggacacagtcattccctctttaatggtgctctagatcaggcacatggccatgtcgatcattgccatagccatgaagtgaaacatggtgctgcacatagccatgatcatgctcatggacatggacactttcattctcatgatggcccgtccttaaaagaaacaacaggacccagcagacagattttacaaggtgtatttttacatatcctagcagatacacttggaagtattggtgtaattgcttctgccatcatgatgcaaaattttggtctgatgatagcagatcctatctgttcaattcttatagccattcttatagttgtaag；

20、所述外泌體hsa_circ_0074944在基因組上的定位為

21、chr5:169681743-169684350，環(huán)化序列長度為291個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:4所示，具體為：

22、aatccttgagcttgatttgattgtcagagatgaagacggaaatatcttggaccctgataataccagtgtcatcagcttgttccatgcacatgaggaagcaactgataaaatcacagagcgtatcaaagaagaaatgtcaaaagaccagccagattatgcaatgtattcccggatctcctcatcccccacccatagcctctatgtgtttgtgagaaactttgtgtgcagaattggggaagatgctgagctcttcatgtctctctacgaccccaacaagcaaacggtcataag；

23、所述外泌體hsa_circ_0009155在基因組上的定位為

24、chr11:46493607-46494204，環(huán)化序列長度為182個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:5所示，具體為：

25、ggacaatggtgacagatccaggcaccgagctccacgcaatgcccggatgtctgcaccttcgcttggacgctttgtcccaaggcgtttcttgctgcctgagtacttgccttatgctgggatttttcatgaacgtggacagcctggcttggctactcactcttctgttaacagggtcctggcag；

26、所述外泌體hsa_circ_0131642在基因組上的定位為

27、chr6:34646600-34654779，環(huán)化序列長度為353個(gè)堿基，其核苷酸序列如seq?idno:6所示，具體為：

28、gaacctacaagcagcaattggcgcctattatgactttgagagcccaaacatcagtgtgccctctatgt

29、cctttgttgaagatgtcaccataggagaaggggagtcaatacctccggatactcagtttgtaaaaaca

30、tggcggatccagaattctggggcagaggcctggcctccaggggtttgtcttaaatatgtcgggggaga

31、ccaatttggacatgtgaacatggtgatggtgagatcgctagagccccaagagattgcagatgtcagcg

32、tccagatgtgcagccccagcagagcaggaatgtatcagggacagtggcggatgtgcactgctacaggactctactatggag。

33、進(jìn)一步地，所述外泌體circrna用于制備診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的試劑盒、微陣列或生物芯片的標(biāo)志物。

34、進(jìn)一步地，所述外泌體circrna表達(dá)量的檢測(cè)物為引物或探針。

35、進(jìn)一步地，所述引物為采用熒光定量檢測(cè)所述外泌體circrna表達(dá)量的引物組合，具體為：

36、

37、本發(fā)明還提供一種用于診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的試劑盒，所述試劑盒用于檢測(cè)血漿外泌體circrna表達(dá)量，所述外泌體circrna為hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642中任一種或兩種以上的組合。

38、本發(fā)明明確了瓣膜內(nèi)皮下包分泌外泌體及人體血漿外泌體中circrna組合對(duì)疾病的診斷效能，可以通過體外檢測(cè)血液中的血漿外泌體circrna實(shí)現(xiàn)主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的早期診斷。

39、(三)有益效果

40、本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：

41、(1)本發(fā)明選擇血漿外泌體hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642中任一種或兩種以上的分子標(biāo)志物組合作為外泌體circrna表達(dá)量的分子標(biāo)志物，對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化的檢測(cè)準(zhǔn)確率有效提高，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該分子標(biāo)志物的組合的p值＜0.05，|log?fold變化(fc)|＞1，相對(duì)于健康對(duì)照組具有明顯的差異表達(dá)，這將有助于探索這種疾病的發(fā)病機(jī)理，并為cavd的診斷提供新的方向。(2)本發(fā)明公開了源于血漿外泌體circrna的診斷主動(dòng)脈瓣鈣化的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。rt-qpcr結(jié)果表明，hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642等6種人血漿外泌體circrna在主動(dòng)脈瓣鈣化患者與健康對(duì)照組間差異性表達(dá)。利用roc曲線分析6種血漿外泌體circrna的診斷效能，結(jié)果顯示上述外泌體circrna的auc值分別為0.898、0.874、0.833、0.760、0.863、0.857。

42、(3)本發(fā)明證明上述6種血漿外泌體circrna可以作為主動(dòng)脈瓣鈣化的分子診斷標(biāo)志物。將其制成診斷試劑盒、微陣列或生物芯片，通過檢測(cè)受試者血漿外泌體circrna的表達(dá)量，對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化進(jìn)行快速診斷和判定：當(dāng)外泌體hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642表達(dá)量上調(diào)，則提示該受試者患有主動(dòng)脈瓣鈣化，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

43、(4)本發(fā)明提供的試劑盒通過檢測(cè)血漿外泌體circrna表達(dá)量來診斷主動(dòng)脈瓣鈣化，其中外泌體hsa_circ_0087765，hsa_circ_0062397，hsa_circ_0000098，hsa_circ_0074944，hsa_circ_0009155，hsa_circ_0131642中任一種或兩種以上的分子標(biāo)志物組合，對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化的檢測(cè)準(zhǔn)確率有效提高，該分子標(biāo)志物的組合的p值＜0.05，|log?fold變化(fc)|＞2，相對(duì)于健康對(duì)照組具有明顯的差異表達(dá)，為主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的臨床早期檢測(cè)提供了新的有效方案。