本發(fā)明屬于生物，具體地，涉及chrm3基因多態(tài)性在阿托品易感近視人群診斷或篩查中的應(yīng)用，更具體地，涉及的snp為rs60234066。

背景技術(shù)：

1、近視不僅是可矯正視力障礙的主要原因，而且還與一系列視力疾病有關(guān)，如近視性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離和脈絡(luò)膜新生血管形成。因此，迫切需要減緩近視的發(fā)展，以防止這些潛在的并發(fā)癥。目前，0.01%阿托品滴眼液已被廣泛研究和評估為減緩兒童近視發(fā)展的最有效藥物。盡管這種藥物被廣泛使用，但有證據(jù)表明，一部分兒科患者對0.01%阿托品滴眼液的反應(yīng)不佳。大約一半的兒童在使用0.01%阿托品治療后，近視每年進展超過0.50d。0.01%阿托品滴眼液的反應(yīng)存在個體差異。導(dǎo)致對0.01%阿托品滴眼液反應(yīng)不佳的機制尚未完全闡明。雖然一些研究將治療反應(yīng)不佳與年齡較小、有近視家族史和初始近視水平較高聯(lián)系起來，但其他研究卻與這些發(fā)現(xiàn)相矛盾。對治療反應(yīng)不佳的預(yù)測因素缺乏共識，這凸顯了采取更有針對性的方法的必要性。開發(fā)適用于阿托品治療效果早期篩查的體外遺傳檢測試劑盒，提升相關(guān)疾病人群的早期干預(yù)率，對于提升臨床指導(dǎo)效果，降低近視進展具有重大意義。

2、基因組關(guān)聯(lián)分析方法通過限定相關(guān)基因集，檢測基因組范圍內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（snp）與表型之間的關(guān)聯(lián)，能夠更有效地識別與阿托品藥物作用效果相關(guān)的遺傳變異。emmax（efficient?mixed-model?association?expedited）作為一種基于混合模型的gwas方法，因其考慮了種群結(jié)構(gòu)和遺傳背景的影響，具有較高的分析精度和計算效率。目前，用于評估阿托品治療效果的傳統(tǒng)方法主要依賴于臨床表型的觀察，如視力變化、眼軸長度的變化等。然而，這些方法往往難以精確預(yù)測個體的治療反應(yīng)。此外，基于統(tǒng)計模型的方法，如線性回歸模型，雖然可以在一定程度上分析基因與表型之間的關(guān)聯(lián)，但在處理復(fù)雜的基因-環(huán)境交互作用時表現(xiàn)不足。此外，目前尚未有針對近視人群從遺傳角度來判斷個體阿托品作用效果的評估，篩選易感人群。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供chrm3基因多態(tài)性在阿托品易感近視人群診斷或篩查中的應(yīng)用，具體涉及的snp為rs60234066，通過檢測所述snp基因型來判斷所述受試人群是否為阿托品易感近視人群。

2、本發(fā)明的上述發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一方面提供了檢測受試者樣本中snp標(biāo)志物的試劑在制備用于診斷或篩查阿托品易感近視人群的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4、進一步，所述snp標(biāo)志物為rs60234066。

5、進一步，所述試劑包括采用直接測序、單堿基延伸、等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性核苷酸摻入、5’核酸酶消化、分子信標(biāo)測定、寡核苷酸連接測定、maldi-tof/ms、rca、印記雜交、點雜交或單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法檢測rs60234066基因型的試劑。

6、進一步，所述阿托品易感近視人群攜帶rs60234066突變（rs60234066?c>ct）。

7、進一步，所述樣本選自血液或組織；

8、可選地，所述試劑包括檢測rs60234066的特異性引物、特異性探針或特異性抗體；

9、可選地，所述試劑還包括處理所述受試者樣本獲得核酸的試劑；

10、可選地，所述產(chǎn)品包括試劑盒或芯片。

11、在一些實施方案中，所述snp（single?nucleotide?polymorphism）是指單核苷酸多態(tài)性，即由于單個核苷酸的改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性。?這種變異在人類基因組中非常常見，據(jù)估計，在每千個堿基中大約有一個snp?。

12、在一些實施方案中，所述snp標(biāo)志物rs60234066為chrm3基因上的snp位點。所述chrm3（cholinergic?receptor?muscarinic?3?[homo?sapiens?(human)]）基因在ncbi中對應(yīng)的gene?id為1131，其對應(yīng)的詳細(xì)信息可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/獲取。

13、在一些實施方案中，所述受試者是指任何動物，還指人類和非人類的動物。所述非人類的動物包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物，如非人靈長類動物（特別是高等靈長類動物）、綿羊、狗、嚙齒類動物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛、和任何家畜或?qū)櫸?；以及非哺乳動物，如雞，兩棲類，爬行動物等，在優(yōu)選的實施方案中，所述受試者為人，在更優(yōu)選的實施方案中，所述受試者為近視人群。

14、在一些實施方案中，所述樣本是指含有或假定含有靶核酸的任何組合物。這包括從個體分離的組織或流體的樣品，例如，皮膚、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、淚液、血細(xì)胞、器官，并且也表示從取自個體的細(xì)胞建立的體外培養(yǎng)物的樣品，包括福爾馬林固定的石蠟包埋的組織（ffpet）和從其分離的核酸。樣品還可以包括無細(xì)胞材料，諸如含有無細(xì)胞dna（cfdna）級分。樣品還可以指處理的組織或生物流體，例如，純化或部分純化的核酸。

15、在一些實施方案中，所述基因型是指存在于個體或樣品中的等位基因的同一性。典型地，其指與感興趣的特定基因相關(guān)的個體的基因型；在多倍體個體中，其指個體攜帶有基因等位基因的何種組合。

16、在一些實施方案中，所述檢測snp位點的試劑是指特異性地結(jié)合到所述snp標(biāo)志物或snp，以便于識別，或者可以檢測所述snp并擴增的制劑，可以擴增snp標(biāo)志物的試劑是指反復(fù)復(fù)制包括在所述snp標(biāo)志物組合物的snp標(biāo)志物或snp，并增加其數(shù)量的試劑，例如，特異地擴增包括所述snp的多核苷酸的引物或者可以特異結(jié)合的探針，但不受此限定。

17、用于所述snp擴增的引物可以是適當(dāng)緩沖劑中的妥當(dāng)條件（例如，4種不同核苷三磷酸、dna、rna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶等聚合劑）以及在妥當(dāng)溫度下，可以作為柱狀顯示dna合成的起點，起作用的單鏈寡核苷酸，根據(jù)使用目的，所述引物的妥當(dāng)長度會有不同，但通常是15至30個核苷酸。短的引物分子通常為了形成柱狀和穩(wěn)定的混合體，需要更低的溫度。所述引物序列不需要與包括所述snp的多核苷酸形成完整的互補性，但其互補性需要達(dá)到可以與包括所述snp的多核苷酸混合的程度。

18、在一些實施方案中，所述引物同擴增引物，所述引物是指可以在擴增方法（如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)）中使用來基于對應(yīng)于目的基因的多核苷酸序列擴增核苷酸序列的寡核苷酸。所述引物通常是指包含5-100個核苷酸的核酸片段，在優(yōu)選的實施方案中，所述引物或擴增引物包含能起始酶促反應(yīng)（例如，酶促擴增反應(yīng)）的15-30個核苷酸。

19、在一些實施方案中，所述探針是指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。在另一些實施方案中，探針是指可間接地或直接地、共價地或非共價地結(jié)合至本文公開的任何底物和/或反應(yīng)產(chǎn)物和/或蛋白酶的任何分子或與其相關(guān)，并且其相關(guān)或結(jié)合可使用本文公開的方法檢測。在另一些實施方案中，探針是熒光探針、抗體或基于吸光度的探針。如果是基于吸光度的探針，發(fā)色團pna（對硝基苯胺）可用作檢測和/或定量本文公開的靶核酸序列的探針。在一些實施方案中，探針可以是包含熒光分子或底物的核酸序列，該熒光分子或底物在暴露于酶時變?yōu)榘l(fā)熒光的，并且該核酸序列與一種核酸序列的片段互補。

20、除非另有指出，在本發(fā)明中，探針通常是指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸（往往稱為靶多核苷酸）結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。雜交方式包括但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。本發(fā)明中的示例性探針包括基因特異性dna寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護檢驗探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

21、在一些實施方案中，用于所述snp位點檢測的探針可以是混合探針，也可以是可以依據(jù)特異序列結(jié)合到核酸互補性鏈條的寡核苷酸?；旌蠗l件要在等位基因之間的混合強度上顯示出顯著差異，以進行嚴(yán)格控制，使其僅混合到等位基因中之一。最佳地，本發(fā)明所述的探針的中心部位與多樣性序列的多樣性部位排列。因此，可能會產(chǎn)生相互不同等位基因性形態(tài)之間的優(yōu)化混合差異。所述探針可以應(yīng)用于檢測等位基因，此外，可以用放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合物或酶對所述探針做標(biāo)記。妥當(dāng)標(biāo)記所述探針是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可以采用常規(guī)方法實施。

22、在一些實施方案中，所述抗體是指是本領(lǐng)域眾所周知的，所述抗體是指針對抗原位點的特異性免疫球蛋白。本發(fā)明中所述的抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)方法來制造抗體。抗體的形式包括多克隆抗體或單克隆抗體、抗體片段（諸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段）、單鏈fv(scfv)抗體、多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原結(jié)合位點的融合蛋白，以及包含抗原結(jié)合位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要該抗體表現(xiàn)出所需的生物學(xué)結(jié)合活性即可。

23、在一些實施方案中，所述檢測rs60234066基因型可采用如下方法中的任一種或多種進行檢測：直接測序、單堿基延伸、等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性擴增、等位基因特異性核苷酸摻入、5’核酸酶消化、分子信標(biāo)測定、寡核苷酸連接測定、maldi-tof/ms、rca、印記雜交、點雜交或單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法。需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇上述任一種或多種方法（不限于上述方法）來檢測本發(fā)明所述的snp位點，只要可以實現(xiàn)對所述snp位點基因型進行檢測或?qū)λ鰏np位點是否發(fā)生突變進行檢測的方法均可應(yīng)用于本發(fā)明。

24、在一些實施方案中，所述直接測序法是檢測snp是最直接可靠的方法，檢出率高達(dá)100%，代表測序技術(shù)有焦磷酸測序（pyrosequencing）、taqman技術(shù)、微測序（snapshot）等。該方法通過比對不同樣本中的同一基因或是基因片段的pcr擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果，或是重測序分析已定位的序列標(biāo)簽位點（sts）及表達(dá)序列標(biāo)簽（est）來檢測snp?？梢詫cr產(chǎn)物純化回收后通過連接到載體上進行測序，也可以對pcr產(chǎn)物直接進行測序。通過序列的比對，就能夠準(zhǔn)確地檢測snp的突變類型和位置。

25、在一些實施方案中，所述等位基因特異性擴增（allele-specific?pcr，as-pcr）的原理是由于taq?dna聚合酶對位于引物3’末端的單個堿基的錯配無法修復(fù)，當(dāng)引物3’末端的堿基與snp位點的等位基因互補配對時，才能發(fā)生擴增反應(yīng)；當(dāng)引物3’末端的堿基與snp位點的等位基因不互補配對時，則擴增反應(yīng)不能發(fā)生。目前，已出現(xiàn)了基于as-pcr改良的一些方法，如四引物擴增受阻突變體系pcr（tetra-primer?amplificationrefractorymutation?system?pcr，tetra-primer?arms-pcr）、片段長度差異等位基因特異pcr（fragment?length?discrepant?allele?specific?pcr，fldas-pcr）、多等位基因特異擴增（pcr?amplification?of?multiple?specific?alleles，pmasa）等。

26、本發(fā)明的第二方面提供了一種用于診斷或篩查阿托品易感近視人群的產(chǎn)品。

27、進一步，所述產(chǎn)品包括檢測受試者樣本中snp位點rs60234066基因型的試劑。

28、進一步，所述產(chǎn)品包括檢測rs60234066的特異性引物、特異性探針或特異性抗體；

29、可選地，所述產(chǎn)品還包括處理所述受試者樣本獲得核酸的試劑；

30、可選地，所述產(chǎn)品包括試劑盒或芯片。

31、在一些實施方案中，所述試劑盒包括但不限于：pcr試劑盒、rt-pcr試劑盒或dna芯片試劑盒。

32、在一些實施方案中，所述pcr試劑盒除了所述snp的特異多核苷酸、引物或探針之外，pcr試劑盒還可以包括：試管或其他妥當(dāng)容器、反應(yīng)緩沖液（多種ph及鎂濃度）、脫氧核苷酸（dntps）、taq-聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶等酶、dnase、rnase抑制劑、depc-水（depc-water）及滅菌水等。

33、在一些實施方案中，所述rt-pcr試劑盒除了所述snp的特異性各種引物之外，rt-pcr試劑盒還可以包括：試管或其他妥當(dāng)容器、反應(yīng)緩沖液（多種ph及鎂濃度）、脫氧核苷酸（dntps）、雙脫氧核苷酸（ddntps）、taq-聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶等酶、dnase、rnase抑制劑、depc-水（depc-water）及滅菌水等。

34、在一些實施方案中，所述dna芯片試劑盒可以是包括運行dna芯片時必備成分的試劑盒，dna芯片試劑盒包括：貼附所述snp的特異多核苷酸、引物或探針的基板，基板可以包括相當(dāng)于定量對比區(qū)或其片段的核酸。

35、在一些實施方案中，所述芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于所述snp位點rs60234066所在的序列。

36、在一些實施方案中，所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域常用的各種材料，例如包括但不限于：塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團，易與抗體（抗原）形成化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。

37、本發(fā)明的第三方面提供了一種基于chrm3基因上的snp位點rs60234066篩查或預(yù)測阿托品易感近視人群的方法。

38、進一步，所述方法包括：

39、獲取待測樣本中chrm3基因上的snp位點數(shù)據(jù)；

40、提取所述chrm3基因上的snp位點rs60234066的基因型數(shù)據(jù)；

41、基于所述snp位點rs60234066的基因型數(shù)據(jù)進行分類預(yù)測，得到待測樣本是否為阿托品易感近視人群樣本的分類結(jié)果。

42、進一步，所述分類結(jié)果是基于所述snp位點rs60234066的基因型是否發(fā)生突變進行分類預(yù)測得到的；

43、若所述snp位點rs60234066的基因型發(fā)生突變，則所述待測樣本為阿托品易感近視人群樣本；

44、若所述snp位點rs60234066的基因型未發(fā)生突變，則所述待測樣本為非阿托品易感近視人群樣本。

45、本發(fā)明的第四方面提供了一種基于chrm3基因上的snp位點rs60234066篩查或預(yù)測阿托品易感近視人群的系統(tǒng)。

46、進一步，所述系統(tǒng)包括：

47、獲取數(shù)據(jù)單元，獲取待測樣本中chrm3基因上的snp位點數(shù)據(jù)；

48、提取數(shù)據(jù)單元，提取所述chrm3基因上的snp位點rs60234066的基因型數(shù)據(jù)；

49、預(yù)測結(jié)果單元，基于所述snp位點rs60234066的基因型數(shù)據(jù)進行分類預(yù)測，得到待測樣本是否為阿托品易感近視人群樣本的分類結(jié)果；

50、所述分類結(jié)果是基于所述snp位點rs60234066的基因型是否發(fā)生突變進行分類預(yù)測得到的；

51、若所述snp位點rs60234066的基因型發(fā)生突變，則所述待測樣本為阿托品易感近視人群樣本；

52、若所述snp位點rs60234066的基因型未發(fā)生突變，則所述待測樣本為非阿托品易感近視人群樣本。

53、本發(fā)明的第五方面提供一種基于chrm3基因上的snp位點rs60234066篩查或預(yù)測阿托品易感近視人群的設(shè)備。

54、進一步，所述設(shè)備包括：存儲器和處理器，所述存儲器用于存儲程序指令；所述處理器用于調(diào)用程序指令，當(dāng)程序指令被執(zhí)行時實現(xiàn)本發(fā)明第三方面所述的基于chrm3基因上的snp位點rs60234066篩查或預(yù)測阿托品易感近視人群的方法。

55、本發(fā)明的第六方面提供了一種計算機可讀存儲介質(zhì)。

56、進一步，所述計算機可讀存儲介質(zhì)上存儲有計算機程序，所述計算機程序被處理器執(zhí)行時實現(xiàn)本發(fā)明第三方面所述的基于chrm3基因上的snp位點rs60234066篩查或預(yù)測阿托品易感近視人群的方法。

57、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果如下：

58、本發(fā)明首次從中國阿托品使用的近視人群全基因組測序數(shù)據(jù)中篩選并驗證了1個snp位點rs60234066可以作為阿托品相關(guān)受體在近視人群中的有效檢測標(biāo)志物，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了所述snp位點rs60234066和阿托品易感近視人群的診斷相關(guān)，通過檢測所述snp基因型來判斷所述受試人群是否為阿托品易感近視人群，所述snp位點rs60234066對阿托品易感近視人群的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，可用于阿托品易感近視人群的早期診斷或篩查中，以提升相關(guān)疾病人群的早期干預(yù)率，進而提升相關(guān)疾病人群的臨床指導(dǎo)效果，降低近視進展，臨床應(yīng)用前景廣闊。