本發(fā)明涉及分子標(biāo)記輔助育種，具體地，涉及一種snp分子標(biāo)記組合在雞冠厚度輔助育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞冠是雞第二性征中最明顯、最重要的特征，可作為衡量性成熟程度的指標(biāo)。雞冠發(fā)育是性發(fā)育的表型特征，活雞或冰鮮雞上市時，雞冠均需要達到一定的發(fā)育程度，一般要求雞冠直立、大而紅，不倒冠。雞冠厚度是影響雞冠是否倒冠的重要因素。健康雞的雞冠一般是直立、顏色發(fā)紅的，生病、免疫力下降的不健康雞通常會發(fā)生倒冠、雞冠發(fā)白等現(xiàn)象。雞冠是反應(yīng)雞健康狀況、抗病性和營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)。雞冠表皮中含有默克細(xì)胞，同時分布較大的動脈和一些垂直排列的神經(jīng)，能夠感知外部刺激，雞冠發(fā)育是受多基因控制的數(shù)量性狀。

2、雞冠厚度性狀屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到多基因控制，目前還未發(fā)現(xiàn)雞冠厚度顯著相關(guān)的分子標(biāo)記的報道。目前在雞冠厚度育種過程中通常以直接測定雞冠厚度或肉眼觀察雞冠厚度進行選育，世代遺傳進展緩慢。因此，尋找雞冠厚度顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，對于提高雞冠厚度世代選育進展具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對雞冠厚度世代選育進展緩慢的問題，本發(fā)明提供了一種snp分子標(biāo)記組合在雞冠厚度輔助育種中的應(yīng)用，通過4個與雞冠厚度顯著相關(guān)的snp分子標(biāo)記輔助提高雞冠厚度的選育，加快雞冠厚度世代選育進展。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種snp分子標(biāo)記組合在雞冠厚度輔助育種中的應(yīng)用，該snp分子標(biāo)記組合對應(yīng)于ncbi中公布的雞參考基因組bgalgal1.mat.broiler.grcg7b版本序列信息如下：

3、 snp位點 染色體位置 snp?id 候選基因 參考基因組 突變位點 snp1 2:17552900 rs312557738 pip4k2a c t snp2 8:3774588 rs317557994 atf6b a g snp3 8:3798861 rs738748642 olfml2b g a snp4 14:4243547 rs312962270 rnf216 g a

4、磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶2α(pip4k2a)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝穩(wěn)態(tài)和基因組不穩(wěn)定性等方面導(dǎo)致白血病，在淋巴瘤中具有致癌作用。olfml2b(olfactomedin-like?2b)屬于嗅覺蛋白(olfactomedin，olf)家族第ⅳ亞科，參與神經(jīng)發(fā)育和免疫反應(yīng)等正常生理活動的調(diào)節(jié)。環(huán)指蛋白216(ring?finger?protein?2l6，rnf2l6)是含有ring結(jié)構(gòu)域的e3泛素連接酶，抑制過度的炎癥反應(yīng)。目前pip4k2a、olfml2b、rnf2l6、atf6β基因要主要集中在參與人類免疫和神經(jīng)功能相關(guān)，在此之前尚未有關(guān)于在雞冠厚度發(fā)育方面的研究報道。發(fā)明人通過gwas(genome-wide?association?studies，全基因組關(guān)聯(lián)分析)分析篩選到這些候選基因的snp位點與雞冠厚度顯著相關(guān)。

5、所述snp分子標(biāo)記的篩選方法如下：

6、以雞基因組bgalgal.mat.broiler.grcg7b(gcf_016699485.2)作為參考，采用gwas測序技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與雞冠厚度顯著相關(guān)的3個區(qū)域，包括4個基因。使用spss16.0軟件的一般線性模型中的單變量方差分析進行多態(tài)性位點基因型與雞冠厚度關(guān)聯(lián)分析和驗證，篩選到4個snp位點的優(yōu)勢基因型。

7、gwas是解析畜禽數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)強有力工具。利用gwas方法研究snp位點與表型值之間的關(guān)聯(lián)，能夠鑒別影響經(jīng)濟性狀的分子標(biāo)記，特別適用于復(fù)雜的數(shù)量性狀。基于此，本發(fā)明通過gwas篩選雞冠厚度分子標(biāo)記，得到4個與雞冠厚度顯著相關(guān)的snp分子標(biāo)記。與候選基因和qtl連鎖分析相比，gwas標(biāo)記密度高，可解析稀有、低頻變異，可分析復(fù)雜性狀的遺傳結(jié)構(gòu)，還可識別新型變異，結(jié)果更可靠。

8、上述snp分子標(biāo)記的引物的核苷酸序列如下：

9、

10、具體地，提高雞冠厚度的選育方法包括如下步驟：

11、(1)測定待選育雞的基因型，所述基因型為上述的snp分子標(biāo)記組合的基因型；

12、(2)選留snp1位點tt、ct優(yōu)勢基因型，snp2位點aa優(yōu)勢基因型，snp3位點gg優(yōu)勢基因型，snp4位點aa和ga優(yōu)勢基因型的待選育雞為雞冠厚度相對高的個體。

13、具體地，步驟(1)中，待選育雞的基因型的測定方法為：

14、(1.1)提取待測雞基因組總dna；優(yōu)選地，所述待測雞的基因組dna由待測雞的翅靜脈采血得到；

15、(1.2)根據(jù)snp分子標(biāo)記組合，利用對應(yīng)引物對通過pcr方法擴增目標(biāo)序列，所述引物對的序列為：

16、snp1f：5’tgcacactggcactccttac3’

17、snp1r：5’cacggcatgaattacacgtt3’

18、snp2f：5’ttgagatgcgctagcaaaaa3’

19、snp2r：5’gctgagaacagccacacaaa3’

20、snp3f：5’tggctttcctgggtggggac3’

21、snp3r：5’tgaatggtttgacttgctgg3’

22、snp4f：5’caactcctgtcttccgtggt?3’

23、snp4r：5’cctctgttcccagaagctgt3’；

24、(1.3)將pcr擴增產(chǎn)物測序后，判斷基因型。

25、pcr產(chǎn)物送生物公司進行測序，將所得序列與雞的參考基因組進行比對，找出多態(tài)性位點。snp位點pcr產(chǎn)物的核苷酸序列如下所示：

26、snp1—150bp處c/t突變，pcr產(chǎn)物長度為217bp。

27、tgcacactggcactccttacagacagcgctgcagcagtgagcccgtggtgccggagctcttcccatcaggttcttgcagttttttggggggggttgttggcttttttccccctctctcccatttcttccgcacaccgcatggggcagtck(c/t)gggctctcaggcaccaggagccgatgtctccgaccttacaaagagctaacgtgtaattcatgccgtg

28、snp2—176bp處a/g突變，pcr產(chǎn)物長度為236bp。

29、ttgagatgcgctagcaaaaaatagtagtcagttttaataattcacaggtagtctgtgaaagcagttgttctttgctaggtggtaatgttgtgggctatcaaaagcattgaaaacaatgggaaaaaatgcccttatcctgaaagtaagaagttaacaactgtgtcctgaaggagatk(a/g)taattcagagtgcccaaaccttgcccagaaacgtgaggtgtttgtgtggctgttctcagc

30、snp3—44bp處g/a突變，pcr產(chǎn)物長度為202bp。

31、tggctttcctgggtggggacgggtgacctcaggggaccctgagk(g/a)acagcgatacccccagcactgtgctcctgctctgaccacagcctctcctgctgcccccagccgtgaatgcacgcagcatggcaccgtgcagccatggagcatcagtggtgtgtgggaaccactgcaagatgttttctcccagcaagtcaaaccattca

32、snp4—94bp處g/a突變，pcr產(chǎn)物長度為180bp。

33、caactcctgtcttccgtggttttacccggctgccagctttgctatgtcagaatgcagagaggagaaacacgcatgattagcaatgagaaattck(g/a)gggtaagatggaggctgaccgagctggccagcaagcctgatgctgccgggaacctgctctgtgcacacagcttctgggaacagagg

34、注：以上序列中標(biāo)注的k為突變位點，括號中為突變堿基，為等位基因突變。

35、優(yōu)勢基因型個體的具體判斷方法為：

36、首先分析單個snp標(biāo)記與雞冠厚度的相關(guān)性，4個snps位點不同基因型間雞冠厚度均差異顯著，snp1(rs312557738)具有3種基因型tt、ct和cc，其中tt和ct基因型個體的雞冠厚度顯著大于cc基因型(p＜0.05)；snp2(rs317557994)具有3種基因型aa、ag、gg，其中aa基因型個體的雞冠厚度顯著大于ag和gg基因型(p＜0.05)；snp3(rs738748642)具有3種基因型aa、ga、gg，其中g(shù)g基因型個體的雞冠厚度顯著大于ga和aa基因型(p＜0.05)；snp4(rs312962270)具有3種基因型aa、ga、gg，其中aa和ga基因型個體的雞冠厚度顯著大于gg基因型(p＜0.05)。采用haploview軟件分析4個snps位點的連鎖不平衡(ld)程度，發(fā)現(xiàn)snp2和snp3不處于強連鎖狀態(tài)(r2＝74<100)，其他位點也不處于強連鎖狀態(tài)，所以不再分析4個snp位點合并基因型與雞冠厚度的相關(guān)性。snp1位點tt、ct基因型，snp2位點aa基因型，snp3位點gg基因型，snp4位點aa和ga基因型為雞冠厚度的優(yōu)勢基因型，可以作為雞冠厚度分子輔助育種的重要分子標(biāo)記。

37、通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明實現(xiàn)了以下有益效果：

38、在雞冠厚度分子標(biāo)記輔助育種中可以通過選留snp1位點tt、ct優(yōu)勢基因型，snp2位點aa優(yōu)勢基因型，snp3位點gg優(yōu)勢基因型，snp4位點aa和ga優(yōu)勢基因型個體，淘汰其他劣勢基因型個體的方法來輔助提高雞冠厚度的選育，加快雞冠厚度世代選育進展。