本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地，涉及檢測血流感染相關(guān)病原體，包括金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、脆弱擬桿菌、無乳鏈球菌、唾液鏈球菌、人葡萄球菌的檢測并區(qū)分的組合物。

背景技術(shù)：

1、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)屬革蘭氏陽性需氧菌，在葡萄球菌屬中其致病性最強(qiáng)，它主要引起局部化膿感染，也可引起肺炎、感染性心內(nèi)膜炎和骨髓炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶使血液凝固，其對抗生素具有較強(qiáng)的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等敏感性高。金黃色葡萄球菌在自然界廣泛存在,空氣、水、灰塵以及人和動物的排泄物中都可檢測到，為條件致病菌，是社區(qū)和醫(yī)院感染常見的病原菌之一。美國疾控中心報道，金黃色葡萄球菌引起的感染位居第二，僅次于大腸埃希菌。作為人和動物健康最具威脅性的細(xì)菌之一，金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(mrsa)攜帶大量的毒力因子，能夠引起廣泛的感染，是引起公共衛(wèi)生安全問題的重點(diǎn)病原菌之一。

2、頭狀葡萄球菌(staphylococcus?capitis)是一種常見的凝固酶陰性葡萄球菌，因常分離于人類的頭、面、頸部而得名。頭狀葡萄球菌是革蘭氏陽性菌,鏡下形態(tài)為球桿狀,排列成v或w形狀。頭狀葡萄球菌在痰液和分泌物中檢出較多,而疾病類型又以肺部感染和傷口感染為主。該菌作為一種條件致病菌可導(dǎo)致各種嚴(yán)重感染，如乳腺炎、復(fù)雜皮膚軟組織感染、人工關(guān)節(jié)感染、心內(nèi)膜炎、起搏器相關(guān)感染、新生兒醫(yī)院獲得性遲發(fā)性膿毒癥等。頭狀葡萄球菌的耐藥種類超過3類，屬于多重耐藥菌，應(yīng)引起臨床重視。頭狀葡萄球菌在血流感染出現(xiàn)的患者中多屬于免疫力較低者，本為條件致病菌的菌屬有可能在這類人群中變?yōu)榧膊〉闹虏【?，故在臨床治療中不能忽視。

3、脆弱擬桿菌(bacteroides?fragilis)是定殖于哺乳動物腸道中的共生菌，同時也是臨床感染病例中常見的條件致病菌。其能分解糖，對膽汁耐受，為類桿菌屬的代表株。脆弱擬桿菌為革蘭氏陰性桿菌，在正常情況下，它能維持消化系統(tǒng)平衡和機(jī)體抵抗力。脆弱擬桿菌常寄生于人的口腔、腸道和女性生殖道，是一種條件致病菌，主要為內(nèi)源性感染，可引起女性生殖系統(tǒng)、胸腔和顱內(nèi)感染。

4、無乳鏈球菌(streptococcus?agalactiae，gbs)是一種革蘭氏陽性球菌，在血清學(xué)中屬于b群，因此也稱為b群鏈球菌，是新生兒感染的首位致病菌，造成新生兒較高的感染率和死亡率。無乳鏈球菌是造成孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥和新生兒腦膜炎的一個重要原因。gbs正常寄居于婦女陰道和人體腸道，30％健康人糞便及25％健康人泌尿生殖系統(tǒng)帶有此菌，非妊娠婦女陰道帶菌率為10.56％，當(dāng)人體免疫功能降低時，會給無乳鏈球菌的感染提供機(jī)會，在孕期，gbs可造成產(chǎn)婦的絨毛膜羊膜炎，導(dǎo)致流產(chǎn)、胎膜早破及宮內(nèi)感染。在分娩的過程中，新生兒經(jīng)過母親gbs污染的產(chǎn)道，可導(dǎo)致生后發(fā)生肺炎、腦膜炎、敗血癥等。

5、唾液鏈球菌(streptococcus?salivarius)是一種革蘭氏陽性球形細(xì)菌，主要定植在人類的口腔和腸道中，在消化道和口腔生態(tài)系統(tǒng)中，該細(xì)菌在建立免疫穩(wěn)態(tài)起到重要作用。它不是引起大多數(shù)牙齒腐爛的細(xì)菌，但是該菌在中性粒細(xì)胞中減少的患者中可引起敗血癥。某些可能導(dǎo)致創(chuàng)傷的程序，例如牙科工作或不當(dāng)刷牙，可能導(dǎo)致微生物進(jìn)入患者的血液中。唾液鏈球菌通常不具有作為高毒生物的潛力。但是，在免疫抑制的患者中，其作為病原微生物的作用得以確立，尤其是在癌癥患者和肝硬化患者中。在肝硬化患者中，唾液鏈球菌產(chǎn)生了與侵入性外科手術(shù)相關(guān)的感染，例如內(nèi)窺鏡下結(jié)扎食管靜脈曲張。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該菌可以在肝硬化患者中引起菌血癥和蜂窩組織炎。

6、人葡萄球菌(staphylococcus?hominis)屬于凝固酶陰性葡萄球菌(cons)的第三種，因其能夠在人體光滑裝置表面形成生物膜的能力，被認(rèn)為是一種潛在的病原體，可在免疫功能低下的患者中引起感染性心內(nèi)膜炎、腦膜炎等不同感染，通常從醫(yī)院獲得性感染患者的標(biāo)本中分離，在醫(yī)療設(shè)備或宿主組織上形成穩(wěn)定的生物膜被認(rèn)為是其主要致病性因素。但是人葡萄球菌是一種罕見的條件致病菌，只有在機(jī)體免疫力低下時才可能引起機(jī)體各部位機(jī)會性感染，因此是新生兒和免疫抑制患者血液中最常見的三種分離株之一，并被認(rèn)為是菌血癥、敗血癥和心內(nèi)膜炎的病因。

7、上述金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、脆弱擬桿菌、無乳鏈球菌、唾液鏈球菌、人葡萄球菌均可引起敗血癥，危機(jī)生命安全，因此早期診斷病原體并給予及時有效的抗感染治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵，能夠大大降低發(fā)病率和病死率。然而，通過臨床癥狀和常規(guī)的實(shí)驗室檢測很難鑒別確定所感染的細(xì)菌種類，而且目前細(xì)菌培養(yǎng)條件較苛刻，造成培養(yǎng)陽性率低，且多重混合感染的培養(yǎng)極為困難，這給感染患者及臨床醫(yī)生帶來很大困擾。

8、目前常用的單管多重檢測體系多采用熔解曲線方法，通過選擇不同的熒光信號，能實(shí)現(xiàn)單管檢測幾十個病原體，但該技術(shù)靈敏度較低，因為熔解曲線法依賴于雙鏈dna的大量積累后，通過檢測其解鏈行為來分析核酸。如果初始模板量很少，在前期積累雙鏈dna的過程中信號變化不明顯，只有當(dāng)模板量達(dá)到一定程度，才能在熔解過程中檢測到明顯的信號變化，并且它依賴于非特異性熒光染料，檢測的是所有雙鏈dna的總量，包括非特異性產(chǎn)物。所以相對而言，其對于低濃度核酸樣本的檢測靈敏度不如探針法，熔解曲線法的靈敏度難以達(dá)到3000copies/ml以內(nèi)。而血流感染患者血液中含有的病原菌載量是非常低的，一般不超過500copies/ml，直接提取血液中的病原菌進(jìn)行檢測需要非常高的靈敏度。所以理論上采用熔解曲線是無法從血液中進(jìn)行檢測的，而熒光pcr法使用特異性探針，僅對目標(biāo)序列進(jìn)行標(biāo)記與檢測，因此更靈敏。熒光pcr的優(yōu)勢在于高特異性和靈敏度。所以，可以使用熒光pcr方法對血液中的病原體直接檢測。

9、因此，本領(lǐng)域需求一種能夠簡單、快速地檢測上述病原體并且靈敏度高、特異性好的產(chǎn)品，特別地，能夠直接檢測血液中的上述病原體，有利于為臨床及時提供治療策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測血流感染相關(guān)病原體的組合物，包括檢測如下相關(guān)病原體中至少4種的上下游引物和探針：

2、如seq?id?no:1～3所示的檢測金黃色葡萄球菌的上下游引物和探針；

3、如seq?id?no:4～6所示的檢測頭狀葡萄球菌的上下游引物和探針；

4、如seq?id?no:7～9所示的檢測脆弱擬桿菌的上下游引物和探針；

5、如seq?id?no:10～12所示的檢測無乳鏈球菌的上下游引物和探針；

6、如seq?id?no:13～15所示的檢測唾液鏈球菌的上下游引物和探針；或

7、如seq?id?no:16～18所示的檢測人葡萄球菌的上下游引物和探針。

8、本發(fā)明提供的聯(lián)檢組合物，主要利用多重?zé)晒鈖cr分析方法對相關(guān)病原體進(jìn)行檢測，從而在單管反應(yīng)體系中同時實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、脆弱擬桿菌、無乳鏈球菌、唾液鏈球菌、人葡萄球菌中至少4種病原體的檢測和區(qū)分，以便為后續(xù)治療提供針對性策略。同時，本發(fā)明的組合物，其檢測的靈敏度更高，達(dá)到200拷貝/ml，相比熔解曲線，其檢測更為準(zhǔn)確，有利于及時提供預(yù)防政策。

9、本發(fā)明提供一種用于檢測血流感染相關(guān)病原體的組合物，包括：

10、如seq?id?no:1～3所示的檢測金黃色葡萄球菌的上下游引物和探針；

11、如seq?id?no:4～6所示的檢測頭狀葡萄球菌的上下游引物和探針；

12、如seq?id?no:7～9所示的檢測脆弱擬桿菌的上下游引物和探針；

13、如seq?id?no:10～12所示的檢測無乳鏈球菌的上下游引物和探針；

14、如seq?id?no:13～15所示的檢測唾液鏈球菌的上下游引物和探針；以及

15、如seq?id?no:16～18所示的檢測人葡萄球菌的上下游引物和探針。

16、進(jìn)一步地，所述組合物包括檢測內(nèi)標(biāo)的上下游引物及探針。

17、在一些具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人源內(nèi)標(biāo)基因。

18、在一個具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是人管家基因。

19、進(jìn)一步地，本發(fā)明組合物不同探針的熒光基團(tuán)彼此互不相同且互不干擾。

20、在本文中，“互不相同且互不干擾”是指組合物中每個探針?biāo)玫臒晒饣鶊F(tuán)是不一樣的，并且不會影響彼此的檢測，即可以利用不同的通道進(jìn)行檢測。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox、cy5以及cy5.5等，這些基團(tuán)吸光值不接近，能選擇不同的通道，因而不會互相干擾。

21、進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以同時包括上述引物和探針組中的一組或多組。在本發(fā)明中，“組”是指檢測一個靶點(diǎn)的互相匹配的上游引物、下游引物和探針。

22、本發(fā)明的組合物可以任意組合成檢測對應(yīng)6個靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測哪幾個靶點(diǎn)，即把對應(yīng)靶點(diǎn)的引物和探針對進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本發(fā)明中。

23、舉例來說，可以包括上述6組引物和探針中的任意5組，可以包括上述6組引物和探針中的任意4組，可以包括上述6組引物和探針中的任意3組，可以包括上述6組引物和探針中的任意2組，也可以包括上述6組引物和探針中的任意1組。

24、在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物用于熒光pcr。

25、在一個具體的實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌探針的熒光報告基團(tuán)為fam；頭狀葡萄球菌探針的熒光報告基團(tuán)為hex；脆弱擬桿菌探針的熒光報告基團(tuán)為rox；無乳鏈球菌探針的熒光報告基團(tuán)為cy5；唾液鏈球菌探針的熒光報告基團(tuán)為quasar?705；人葡萄球菌探針的熒光報告基團(tuán)為atto425。

26、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有非熒光淬滅劑。

27、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有淬滅基團(tuán)，例如mgb、dabcyl?bhq-0、bhq1、bhq2或bhq3。

28、進(jìn)一步地，所述組合物中單條引物的用量為0.01～0.5μm；所述組合物中單條探針的用量為0.005～0.2μm。

29、在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分分別存在于單獨(dú)包裝中。

30、在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分存在于同一個包裝中。

31、進(jìn)一步地，本發(fā)明的組合物的各成分以混合的形式存在。

32、第二方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明的組合物在制備用于檢測血流感染相關(guān)病原體的試劑盒中的用途，其中，所述相關(guān)病原體的類型為金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、脆弱擬桿菌、無乳鏈球菌、唾液鏈球菌、人葡萄球菌的一種或多種。

33、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測血流感染相關(guān)病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述本發(fā)明的組合物。

34、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

35、在一個具體的實(shí)施方案中，陰性質(zhì)控品是depc?h2o、生理鹽水、內(nèi)標(biāo)基因中的至少一種。陽性質(zhì)控品是金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、脆弱擬桿菌、無乳鏈球菌、唾液鏈球菌、人葡萄球菌的質(zhì)?；蚱位蛑械闹辽僖环N。

36、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸擴(kuò)增試劑。

37、更進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增試劑包括dntp(u)s、pcr緩沖液、dna聚合酶，以及mg2+中的至少一種。

38、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：核酸釋放試劑、核酸提取試劑。

39、進(jìn)一步地，所述dna聚合酶的濃度為1u/反應(yīng)～15u/反應(yīng)，例如dna聚合酶可以是taq酶。

40、在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括：taq酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探針、ung酶和pcr緩沖液。

41、pcr緩沖液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton?x-100等組分構(gòu)成。一般單個pcr反應(yīng)管中總體積為20μl～200μl。

42、第四方面，提供了一種用于用于檢測血流感染相關(guān)病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

43、1)提取待測樣本的核酸；

44、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

45、3)獲得并分析結(jié)果。

46、在本發(fā)明中，用于檢測的樣本可以是血清、血液等，但不限于此。

47、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

48、ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

49、在一個具體的實(shí)施方案中，提供了一種用于以非診斷目的的用于檢測血流感染相關(guān)病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

50、1)提取待測樣本的核酸；

51、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

52、3)獲得并分析結(jié)果。

53、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

54、ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

55、在一個具體的實(shí)施方案中，提供了一種組合物用于制備用于檢測血流感染相關(guān)病原體的試劑的用途，所述用途檢測以下步驟：

56、1)提取待測樣本的核酸；

57、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

58、3)獲得并分析結(jié)果。

59、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

60、ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時間為1～5分鐘，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時間為5～30秒，退火，溫度為55℃～60℃，時間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

61、在本文中，術(shù)語“非診斷目的”指并非旨在獲得個體是否感染上述病原體并罹患感染的信息。例如，該方法可以檢測環(huán)境以及培養(yǎng)物是否有上述病原體。