本發(fā)明屬于食品工程，具體涉及一株馬克斯克魯維酵母、玫瑰風(fēng)味咖啡豆的發(fā)酵方法及咖啡豆。

背景技術(shù)：

1、卡蒂姆咖啡豆最早產(chǎn)于印度南部卡納塔克邦的卡蒂姆地區(qū)。卡蒂姆咖啡豆屬于阿拉比卡品種，主要有金杰和希利諾兩個變種，其中希利諾品種的質(zhì)量略優(yōu)于金杰?？ǖ倌房Х榷箤儆诟咂焚|(zhì)的阿拉比卡種，以香味細(xì)膩、酸度適中、余韻悠長而聞名，并且呈現(xiàn)柔和的可可、堅果和干果香氣，泡制后泡湯柔順清透。一直以來，卡蒂姆咖啡豆主要采用濕法加工，即將新鮮咖啡果進行去果皮、發(fā)酵、清洗等工序,最后進行緩慢陰干，從而最大限度保留其獨特的風(fēng)味。

2、卡蒂姆地區(qū)歷來有發(fā)酵處理咖啡的傳統(tǒng)技藝。卡蒂姆地區(qū)的當(dāng)?shù)厝瞬捎靡环N古老的鹽水發(fā)酵的特殊方式，即在發(fā)酵過程中,會適量加入食鹽,利用鹽分的抑菌作用來防止發(fā)酵過程失控。這成為一種以食鹽輔助控制發(fā)酵的獨特工藝，也是卡蒂姆咖啡豆的一個傳統(tǒng)特色。但是，鹽分在咖啡豆中殘留，影響咖啡的最終口感，增加咸味，降低風(fēng)味的純凈度。這使得傳統(tǒng)鹽水發(fā)酵工藝的卡蒂姆咖啡豆市場接受度不高。

3、利用特定的發(fā)酵劑控制咖啡豆發(fā)酵是一種新興的咖啡風(fēng)味調(diào)節(jié)技術(shù)，通過科學(xué)手段調(diào)控咖啡豆的發(fā)酵過程，以改善和增強咖啡的風(fēng)味。利用特定的發(fā)酵劑控制咖啡豆發(fā)酵的關(guān)鍵點是選擇特定發(fā)酵劑以及進行二次發(fā)酵?？Х榷共捎玫陌l(fā)酵劑通常是特定的微生物，如乳酸菌、酵母菌等，這些微生物在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物可以顯著影響咖啡的風(fēng)味，增加酸度、甜度或賦予特定的香氣。二次發(fā)酵是在初步發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進一步利用外源微生物進行發(fā)酵處理。在發(fā)酵過程中，外源微生物可以產(chǎn)生特定的酶和代謝產(chǎn)物，進一步改進咖啡豆的化學(xué)成分。這些變化可以提升咖啡的風(fēng)味品質(zhì)，如增加花香、果香，提升酸度和甜度。這樣可以促進咖啡風(fēng)味的豐富感，咖啡口感更加醇厚獨特?？梢?，使用科學(xué)的發(fā)酵劑控制可以減少不良風(fēng)味的產(chǎn)生，實現(xiàn)咖啡的精品率。

4、云南小?？Х戎锌ǖ倌贩N植居多，因云南獨特的地理環(huán)境和氣候條件，具有顯著的特色風(fēng)味。從咖啡豆的感官品鑒上，卡蒂姆商業(yè)水洗豆通常酸度適中，口感飽滿，常帶有獨特的柑橘、漿果等水果香氣，以及花香、堅果等香氣。從咖啡豆的質(zhì)量上，由于云南的卡蒂姆商業(yè)水洗豆的主產(chǎn)區(qū)包括普洱市、臨滄市、保山市、德宏州和西雙版納州，這些地區(qū)的生產(chǎn)管理較為規(guī)范，種植技術(shù)和加工工藝也較為成熟，保證了卡蒂姆商業(yè)水洗豆的穩(wěn)定質(zhì)量。另外，云南具有豐富的鮮花資源和悠久的食用鮮花歷史，通過在咖啡發(fā)酵過程中加入鮮花元素，鮮花中的芳香物質(zhì)在發(fā)酵過程中可以滲透到咖啡豆中，提升原有咖啡豆的風(fēng)味品質(zhì)，具有開發(fā)創(chuàng)新風(fēng)味咖啡產(chǎn)品的潛力。

5、cf?silva等人在文章succession?of?bacterial?and?fungal?communitiesduring?natural?coffee(coffea?arabica)fermentation(2008，food?microbiology)中提出，天然咖啡發(fā)酵過程中，細(xì)菌和真菌群落呈現(xiàn)出復(fù)雜的繼承模式，不同微生物在發(fā)酵的不同階段發(fā)揮不同的作用。并且酵母菌如pichia?anomala和pichia?guilliermondii在發(fā)酵過程中對咖啡的風(fēng)味和品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。

6、同樣地，wafa?masoud等人在文章yeast?involved?in?fermentation?ofeastafrican?coffee?genotyped?and?determinedby?direct?denaturing?gradient?gelelectrophoresis(2004，yeast)中提出，在咖啡發(fā)酵過程中，不同地點和處理方法可能導(dǎo)致微生物群落的差異。尤其是坦桑尼亞的加工場所由于早期生產(chǎn)的微生物殘留，可能導(dǎo)致更高的pichia?kluyveri酵母菌含量。東非等不同地理位置的咖啡發(fā)酵過程中微生物的多樣性和動態(tài)變化表明，有必要改進現(xiàn)有的咖啡豆發(fā)酵工藝。

7、中國發(fā)明(cn?114365784?a)公開了一種利用微生物發(fā)酵改善咖啡風(fēng)味的方法，采用不同復(fù)合菌聯(lián)合發(fā)酵得到不同風(fēng)味的咖啡，在發(fā)酵中加入白砂糖或紅糖會顯著增加發(fā)酵基質(zhì)中的糖分含量。這會導(dǎo)致發(fā)酵菌體(如酵母菌)快速繁殖，消耗糖分生成乙醇和二氧化碳。糖分過高容易導(dǎo)致發(fā)酵速度過快，產(chǎn)生過量的乙醇，導(dǎo)致咖啡豆有明顯的酒精味，影響其原有的風(fēng)味特性。過多的糖分容易促進某些菌種(如酵母菌)的過度生長，并且抑制其他有益菌種(如乳酸菌)的生長，導(dǎo)致發(fā)酵過程中的微生物生態(tài)失衡。微生物生態(tài)失衡會導(dǎo)致發(fā)酵不均勻，產(chǎn)生不良的風(fēng)味化合物，如不良的酸味或苦味。甚至，高糖環(huán)境可能改變發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)地，使咖啡豆變得過于粘稠或不易干燥。

8、中國發(fā)明(cn?115868566?a)公開了一種定向風(fēng)味發(fā)酵咖啡的制備方法，采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)測定咖啡烘焙豆揮發(fā)性組分，獲得與感官相關(guān)的化學(xué)組分，并選擇含有所述化學(xué)組分的天然可食材料，即得風(fēng)味底物；再加入乳酸乳球菌進行密閉培養(yǎng)，從而得到定向風(fēng)味發(fā)酵的咖啡豆。該方法的缺陷是風(fēng)味底物與咖啡生豆混合后在100℃溫度下滅菌30min，經(jīng)過100℃高溫長時間滅菌后，風(fēng)味底物會發(fā)生改變或揮發(fā)散失。高溫環(huán)境會導(dǎo)致一些熱敏感風(fēng)味化合物降解，尤其是酯類和醇類化合物，這會直接影響風(fēng)味質(zhì)量。進一步地，水分的喪失和熱處理容易導(dǎo)致底物和咖啡豆的質(zhì)地變硬，影響咖啡的口感和品質(zhì)。甚至，高溫滅菌會促進美拉德反應(yīng)(氨基酸和還原糖之間的反應(yīng))，導(dǎo)致顏色變深并產(chǎn)生苦味和不良風(fēng)味。

9、中國發(fā)明(cn?111543534?a)公開了一種能提升咖啡豆芳香物質(zhì)的發(fā)酵方法，采用在加壓和恒溫恒濕條件下采用有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵，并且添加可溶性果糖和/或葡萄糖得到咖啡豆。該方法的缺陷是添加果糖或葡萄糖會直接增加咖啡的甜味，甚至掩蓋咖啡豆原有的復(fù)雜風(fēng)味，使咖啡風(fēng)味不自然。糖分的增加可能會影響咖啡的酸度平衡。高糖環(huán)境下的發(fā)酵過程容易產(chǎn)生較多的酸性物質(zhì)，如乙酸，導(dǎo)致酸度過高，影響咖啡的整體口感。同時，糖分增加導(dǎo)致發(fā)酵液的粘性增加，影響發(fā)酵過程中的氣體交換和熱量傳導(dǎo)，不利于均勻發(fā)酵。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與不足，本發(fā)明旨在一株馬克斯克魯維酵母、玫瑰風(fēng)味咖啡豆的發(fā)酵方法及咖啡豆。利用本發(fā)明所述的發(fā)酵方法，能夠制備出一款高品質(zhì)的玫瑰風(fēng)味咖啡，這款咖啡具有明顯的玫瑰花香、黃糖般的甜感、柔和的酸質(zhì)中帶著回甘，且有著杏仁、巧克力、堅果的調(diào)性，從高溫到低溫均能感受到迷人的玫瑰花香的發(fā)酵咖啡，品鑒評分為81.25分。

2、具體地，本發(fā)明的第一目的是對馬克斯克魯維酵母已經(jīng)進行菌株保藏，并附有該菌株的獲取方式和鑒定結(jié)果。本發(fā)明的第二目的是采用用馬克斯克魯維酵母對咖啡豆進行定向風(fēng)味發(fā)酵，做到咖啡風(fēng)味控制，排除有害微生物污染，降低發(fā)酵過程中的安全風(fēng)險，提高咖啡產(chǎn)品安全性。本發(fā)明的第三目的是在發(fā)酵過程中添加食用玫瑰花，所述添加食用玫瑰花需要進行預(yù)處理，進而在酵母菌的作用下，使玫瑰風(fēng)味融合于咖啡之中，制備出一款具有穩(wěn)定品質(zhì)的玫瑰風(fēng)味的咖啡。本發(fā)明的第四目的是經(jīng)過所述的發(fā)酵方法得到一種玫瑰風(fēng)味咖啡，具備明顯的玫瑰花香，有著黃糖般的甜感、柔和的酸質(zhì)中帶著回甘，且有著杏仁、巧克力、堅果的調(diào)性，從高溫到低溫均能感受到迷人的玫瑰花香的特性。

3、本發(fā)明的第一目的是采用馬克斯克魯維酵母已經(jīng)進行菌株保藏，并附有該菌株的獲取方式和鑒定結(jié)果。

4、其一，所述馬克斯克魯維酵母ci-06保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，ci-06命名為馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)，保藏編號為cgmcc?no：30564，保藏日期為2024年5月9日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

5、其二，所述馬克斯克魯維酵母的獲取方式分為菌株的篩選、菌株的分離純化與保存、菌株的鑒定。

6、(1)馬克斯克魯維酵母菌株的篩選：馬克斯克魯維酵母菌株樣品采集于中國云南省臨滄市傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸肉，貼好標(biāo)簽后進行冷藏保存處理，當(dāng)天運回實驗室放入-80℃冰箱超低溫保存。

7、具體地，稱取5g酸肉樣品于15ml的無菌生理鹽水中，進行混勻后，制成的10-4～10-9的10倍梯度稀釋液。分別吸取0.5ml不同濃度梯度的稀釋液于凝固的ypd瓊脂板，不同稀釋度做三個平行，并使用涂布棒進行涂布，使稀釋液在平板內(nèi)混合均勻?；靹蚝蟮怪闷桨?，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h。

8、(2)馬克斯克魯維酵母菌株的分離純化與保存：觀察平板上菌落形態(tài)，挑取大小、形態(tài)、顏色各不相同的，生長良好的單菌落，采用平板劃線法在ypd瓊脂板上劃線培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2d。菌種劃線純化三代后，轉(zhuǎn)接到試管斜面上編號并培養(yǎng)2d，將斜面試管存于4℃冰箱內(nèi)，用于后期實驗的需要，并做甘油管保存菌種，于-80℃保藏。最終，選取其中具有一致形態(tài)的分離株送去鑒定。

9、(3)馬克斯克魯維酵母菌株的鑒定：用氫氧化鈉溶液處理上述分離細(xì)菌后，從中提取16s?rrna進行擴增，擴增體系如下表1：

10、

11、進一步地，進行pcr產(chǎn)物測序：pcr產(chǎn)物檢測合格后，切割目的條帶進行純化回收，用回收后的產(chǎn)物進行sanger測序。

12、dna提?。菏褂胻singke植物dna提取試劑盒(通用型,貨號：tsp101)。

13、pcr擴增：用菌種鑒定通用引物進行擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析pcr產(chǎn)物條帶是否與目的大小相符，是否單一，有無拖帶。

14、如圖1所示，pcr產(chǎn)物測結(jié)果比對分析，sanger測序結(jié)果用軟件contigexpress進行拼接，并去除兩端不準(zhǔn)的部分。進一步地，批量對拼接序列進行blastn(最新版本v2.13)比對核酸數(shù)據(jù)庫。其中，核酸數(shù)據(jù)庫選擇最新版本的nt庫，通過與nt庫進行blastn比對，即可得到同源序列的accession?number號及物種鑒定和注釋。

15、本發(fā)明的第二目的是提供一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，由發(fā)酵前的準(zhǔn)備(預(yù)處理)、發(fā)酵和后續(xù)處理三個階段實現(xiàn)：

16、(1)預(yù)處理階段：挑選咖啡豆、咖啡豆復(fù)水、滅菌、冷卻。

17、(2)發(fā)酵階段：制備菌懸液(包括活化菌株和離心分離、菌懸液調(diào)配)、接菌(或接種)、發(fā)酵、添加玫瑰花、二次發(fā)酵。

18、(3)后續(xù)處理階段：豆花分離、干燥。

19、具體地，如圖2所示，本發(fā)明旨在一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，由以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

20、(1)預(yù)處理階段：挑選咖啡豆、咖啡豆復(fù)水、滅菌且冷卻。

21、s1.咖啡豆挑選：將原料(云南小粒咖啡-卡蒂姆水洗-商業(yè)豆)中的破碎豆、發(fā)霉豆、蟲蛀豆、斑點豆、貝殼豆、萎縮豆等瑕疵豆及其他雜質(zhì)挑出后備用。

22、s2.咖啡豆復(fù)水：使用室溫的水，以豆水比1：3的比例放入發(fā)酵罐，加水后容積占罐總體積的一半左右，浸泡到咖啡豆灰白色，外觀色澤均勻。

23、s3.滅菌(殺菌)：用無菌封口膜進行封口，在溫度105～115℃，滅菌5～10min。滅菌結(jié)束后進行自然冷卻，溫度降至25～35℃。

24、(2)發(fā)酵階段：菌懸液的制備、接菌(或接種)、發(fā)酵、添加玫瑰花、二次發(fā)酵。

25、s4.制備菌懸液：將已活化好的發(fā)酵菌株離心棄培養(yǎng)基后加入無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至適宜濃度；優(yōu)選地，濃度調(diào)到8lgcfu/ml。

26、s5.接菌：將制備好的菌懸液噴撒至無菌咖啡豆表面，接種后微生物濃度達(dá)6～7lgcfu/ml。

27、s6.發(fā)酵：咖啡豆接種后移入恒溫室,溫度保持在28±2℃，濕度相對濕度在85％以上。發(fā)酵24h。

28、s7.添加玫瑰花：將經(jīng)過紫外殺菌的玫瑰花瓣按咖啡生豆質(zhì)量的10～15％分層加入發(fā)酵罐中。

29、s8.二次發(fā)酵：將加花后的發(fā)酵罐移入恒溫室,溫度保持在28±2℃，濕度相對濕度在85％以上。發(fā)酵48～60h。

30、s9.封口：從滅菌到發(fā)酵完成，發(fā)酵罐均使用微生物培養(yǎng)的封口膜進行封口；此封口膜的孔徑微生物無法通過，氣體可自由通過。

31、(3)后續(xù)處理階段：豆花分離、干燥。

32、s10.豆花分離：將發(fā)酵結(jié)束后的咖啡豆中的玫瑰花挑出僅保留咖啡豆。

33、s11.干燥：將咖啡豆在40～45℃干燥至水分含量低于12％，即制成一種經(jīng)過發(fā)酵的玫瑰風(fēng)味的咖啡。

34、s12.烘焙：取發(fā)酵玫瑰咖啡豆300g放入滾筒式咖啡烘焙機中，入豆溫度為180℃，保持火力為60％，焙炒時間在8～12min，最佳出鍋溫度為205～218℃，即得到中度烘焙咖啡豆(建議中度偏淺)。

35、補充地，為了達(dá)到發(fā)酵的條件，本發(fā)明所述制備菌懸液是發(fā)酵啟動前的重要環(huán)節(jié)，具體需要通過活化馬克斯克魯維酵母菌株、離心分離和加入無菌生理鹽水三個環(huán)節(jié)。

36、s41.活化發(fā)酵菌株環(huán)節(jié)：選擇馬克斯克魯維酵母菌株作為發(fā)酵菌株，并在適宜的培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，確保菌株處于最佳的生長狀態(tài)。

37、s42.離心分離環(huán)節(jié)：將活化好的馬克斯克魯維酵母菌株培養(yǎng)液進行離心分離。離心條件(如轉(zhuǎn)速和時間)需根據(jù)菌種的特性和實驗設(shè)備設(shè)定，一般在5000r/min離心10min。離心完成后，小心棄去上清液，保留沉淀的菌體。

38、s43.加入無菌生理鹽水重懸環(huán)節(jié)：將離心沉淀的菌體用無菌生理鹽水(通常為0.85％nacl溶液)重懸。無菌操作非常重要，以避免污染。調(diào)節(jié)菌懸液的濃度，使其達(dá)到適宜的濃度范圍，通常為6～7lgcfu/ml。濃度的調(diào)整可以通過測量菌液的光密度或直接計數(shù)方法進行。

39、進一步地，活化發(fā)酵菌株環(huán)節(jié)是進行活化馬克斯克魯維酵母菌株并獲取培養(yǎng)基。

40、具體地，所述活化馬克斯克魯維酵母菌株采用ypd培養(yǎng)基(酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖培養(yǎng)基)。具體的ypd培養(yǎng)基配方為酵母提取物為10g/l，蛋白胨為20g/l和葡萄糖為20g/l，將以上三種成分溶于1l蒸餾水中，并進行高壓滅菌(121℃，15min)。

41、具體地，完成培養(yǎng)基后，需要進行接種和活化培養(yǎng)。所述的接種是將凍干或保藏的馬克斯克魯維酵母菌株在無菌條件下接種到少量的ypd液體培養(yǎng)基中。這里通常使用無菌操作技術(shù)，確保接種過程不被雜菌污染。所述的活化培養(yǎng)是在25℃～30℃的恒溫?fù)u床上進行培養(yǎng)，搖速為150rpm左右，培養(yǎng)時間為24h?；罨囵B(yǎng)有助于激活酵母細(xì)胞，使其從休眠狀態(tài)進入活躍的生長狀態(tài)。

42、具體地，接種和活化培養(yǎng)完成后，需要進行顯微鏡檢查，有時需要擴展培養(yǎng)。所述顯微鏡檢查的取少量培養(yǎng)液在顯微鏡下觀察，檢查酵母細(xì)胞的活性和純度。所述擴展培養(yǎng)是當(dāng)需要更多菌液的情況，需要將活化后的菌液接種到更多的ypd培養(yǎng)基中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)至所需量。

43、進一步地，離心分離環(huán)節(jié)是對完成活化的馬克斯克魯維酵母菌株培養(yǎng)液進行離心分離。

44、具體地，所述離心分離環(huán)節(jié)使用的設(shè)備為高速冷凍離心機、離心管以及無菌操作臺；所述離心分離的材料為活化好的馬克斯克魯維酵母菌株培養(yǎng)液。

45、具體地，所述離心分離的方法是：首先準(zhǔn)備和裝管，將培養(yǎng)液按量分裝到離心管中，每個離心管液體體積相等，然后封好離心管，放置在離心機轉(zhuǎn)子上，確保對稱放置。接著，設(shè)置高速冷凍離心機的離心條件，具體為離心機轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時間為10min。接下來進行離心運行，即啟動離心機，進行10min的離心分離；離心結(jié)束后，緩慢關(guān)閉離心機并取出離心管。最后進行上清液去除和菌體收集，小心地傾倒上清液，避免擾動沉淀的菌體，并且保留沉淀部分(馬克斯克魯維酵母菌體)備用。

46、具體地，所述離心分離環(huán)節(jié)使用高速冷凍離心機，務(wù)必確保溫度設(shè)置在4℃，以保持酵母菌的活性。在進行離心前務(wù)必檢查離心管是否平衡，以避免設(shè)備損壞導(dǎo)致失敗。整個離心分離過程中保持無菌操作，防止外界污染。

47、進一步地，加入無菌生理鹽水重懸環(huán)節(jié)是對沉淀的馬克斯克魯維酵母菌體用無菌生理鹽水重懸；優(yōu)選地，菌懸液濃度調(diào)到8lgcfu/ml。這樣能確保菌懸液的無菌和適宜的濃度，為后續(xù)發(fā)酵過程提供高質(zhì)量的菌源。

48、具體地，所述加入無菌生理鹽水重懸環(huán)節(jié)的工具為無菌吸管或移液器、分光光度計或平板計數(shù)法設(shè)備；所述所述加入無菌生理鹽水重懸環(huán)節(jié)的材料為無菌生理鹽水(0.85％nacl)和進過離心沉淀的馬克斯克魯維酵母菌體。

49、具體地，所述加入無菌生理鹽水重懸的方法是：首先準(zhǔn)備無菌生理鹽水，調(diào)配成配制0.85％的nacl溶液，滅菌并冷卻至室溫。接著進行重懸菌體，先小心棄去離心管中的上清液，再使用無菌吸管加入適量無菌生理鹽水至離心管中，輕輕混勻，使沉淀菌體完全重懸。下一步進行濃度調(diào)節(jié)，可以使用光密度測量法或者直接計數(shù)法。所述光密度測量法是將部分菌懸液轉(zhuǎn)移至分光光度計比色皿中，測量od600值；根據(jù)測得的od600值，使用無菌生理鹽水稀釋或濃縮菌懸液，調(diào)整至目標(biāo)od600值(例如0.1～0.2)。所述直接計數(shù)法是取適量菌懸液，進行梯度稀釋后，涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h；然后進行計數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出原始菌懸液的菌落數(shù)；最后根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整菌懸液濃度。(本發(fā)明所述的方案中，優(yōu)選地，濃度調(diào)到8lgcfu/ml)。

50、具體地，所述加入無菌生理鹽水重懸的全過程需要在無菌操作，在重懸過程中充分混勻，防止菌體團聚影響測量和后續(xù)使用。在重懸過程中充分混勻，防止菌體團聚影響測量結(jié)果。

51、補充地，本發(fā)明的第三目的是在發(fā)酵過程中添加食用玫瑰花，進而在酵母菌促進的作用下，使玫瑰風(fēng)味融合于咖啡之中，制備出一款具有穩(wěn)定品質(zhì)的玫瑰風(fēng)味的咖啡。所添加的食用玫瑰花需要單獨進行預(yù)處理，具體如下：

52、進一步地，為了在發(fā)酵中融合豐富的玫瑰花風(fēng)味的條件，本發(fā)明所述添加玫瑰花是在第一次發(fā)酵后進行的重要環(huán)節(jié)，具體需要通過配比玫瑰花瓣、紫外線殺菌和分層加入玫瑰花瓣三個環(huán)節(jié)。

53、s71.配比玫瑰花瓣：選用新鮮、無病蟲害和無污染的玫瑰花瓣((品種為云南食用玫瑰-大馬士革玫瑰干花)，輕輕清洗并晾干，確保表面沒有泥土或雜質(zhì)；接著計算咖啡豆和玫瑰花瓣的質(zhì)量比例，按照咖啡生豆質(zhì)量的10～15％的比例準(zhǔn)備玫瑰花瓣。

54、s72.紫外線殺菌：將完成配比的玫瑰花瓣均勻地平鋪在一個干凈、不透光的托盤上，確?；ò瓴恢丿B，以便紫外線可以均勻照射到每片花瓣的表面；將托盤放置在紫外線殺菌燈下，啟動紫外線殺菌燈，照射15～30min；照射結(jié)束后，將花瓣放入無菌容器中備用。

55、s73.分層加入玫瑰花瓣：在發(fā)酵罐底部均勻鋪一層咖啡豆，約占總量的四分之一到三分之一；接著，在第一層咖啡豆上均勻撒上一層玫瑰花瓣，使其覆蓋咖啡豆；再鋪上一層咖啡豆(第二層咖啡豆)，確保覆蓋前一層的玫瑰花瓣；繼續(xù)在第二層咖啡豆上再均勻撒上一層玫瑰花瓣；再最后鋪上一層咖啡豆(層)，覆蓋上面的玫瑰花瓣。重復(fù)上述步驟，直到所有的玫瑰花瓣和咖啡豆都已分層加入發(fā)酵罐。

56、補充地，為了檢測本發(fā)明制備獲得利用馬克斯克魯維酵母菌株發(fā)酵的玫瑰咖啡，本發(fā)明進行了水分測定、ph測定和單寧含量分析等理化試驗。

57、(1)水分測定

58、對實施例2、3、4和實施例5中好氧發(fā)酵72h的咖啡豆進行水分含量的測定，測定方法如下所述：采用hs153鹵素水分測定儀測定，準(zhǔn)確稱取2g的咖啡樣品，放入恒重的鋁制盒中，于105℃加熱干燥至重量在90s內(nèi)不再變化，記錄儀器顯示的水分含量，各樣本均重復(fù)三次。實驗結(jié)果如下表2：

59、表2不同實施例水分含量值測定結(jié)果

60、

61、(2)ph測定

62、對實施例2、3、4和實施例5中好氧發(fā)酵72h的咖啡豆進行ph的測定，測定方法如下所述：稱取5.00g咖啡樣品，加入25ml蒸餾水，振蕩20min，使用ph計直接測定。不同實施例的ph測定結(jié)果如下表3：

63、表3不同實施例ph值測定結(jié)果

64、

65、(3)單寧含量分析

66、對實施例2、3、4和實施例5中好氧發(fā)酵72h的咖啡豆進行單寧含量的測定，測定方法如下所述：

67、1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)使用液(200mg/l)0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml，分別置盛有6ml水的10ml比色管中，加福林酚0.5ml，加7.5％碳酸鈉溶液1ml，蒸餾水定容至刻度線，搖勻，靜置30min顯色后，以試劑空白同操作為空白對照，在波長760nm處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以單寧酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

68、2)咖啡試樣的測定：精密量取0.2ml咖啡粉提取物，置盛有6ml水的10ml比色管中，加福林酚0.5ml，加7.5％碳酸鈉溶液1ml，蒸餾水定容至刻度線，搖勻。靜置30min顯色后，以試劑空白同操作為空白對照，在760nm波長處測定試樣溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試液中單寧酸的濃度，結(jié)果如表4所示。

69、表4不同實施例單寧含量濃度值

70、

71、補充地，為了檢測本發(fā)明制備獲得利用馬克斯克魯維酵母菌株發(fā)酵的玫瑰咖啡，本發(fā)明進行了感官評價。

72、對實施例2、3、4和實施例5中好氧發(fā)酵72h后，經(jīng)豆花分離、干燥及烘焙等處理至水分含量10-12％的咖啡豆進行烘焙再進行感官評價，具體評價過程如下所述：

73、s1.研磨：烘焙好的咖啡豆通過20目孔徑的篩網(wǎng)，咖啡粉通過率70-75％為宜。

74、s2.沖泡：11g咖啡粉中注入90-94℃的熱水200ml，4min后依次破渣撈渣，然后進行品評。杯測樣品隨機編碼、標(biāo)號、呈送。

75、s3.由具有q-grader的5位咖啡師進行評定在嗅探、啜飲和回味程序?qū)Х葮悠愤M行評分。風(fēng)味特征從香氣(fragrance/aroma)、干凈度(clean?cup)、甜度(sweetness)、酸質(zhì)(acidity)、醇厚感/口感(body)、風(fēng)味(flavor)、尾韻(aftertaste)、平衡感(balance)、一致性(uniformity)和整體(overall)等十個綜合方面進行評價。

76、感官評價結(jié)論：實施例2取得總分81.25分，實施例3取得總分80.25分,實施例4取得總分80.75分,實施例5取得總分77.50分。此外，品評小組成員一致將馬克斯克魯維酵母菌株進行定向風(fēng)味發(fā)酵后、并且添加玫瑰增香工藝的咖啡豆描述為具有明顯的玫瑰花香，有著黃糖般的甜感、柔和的酸質(zhì)中帶著回甘，且有著杏仁、巧克力、堅果的調(diào)性，從高溫到低溫均能感受到迷人的玫瑰花香的發(fā)酵咖啡，而不接菌處理組發(fā)酵咖啡的強度和風(fēng)味較弱。

77、根據(jù)sca評分要求，80分以上為精品咖啡，利用馬克斯克魯維酵母菌株進行定向風(fēng)味發(fā)酵后、并且添加玫瑰增香工藝對咖啡風(fēng)味有相對顯著的改善，評審組依照sca國際杯測標(biāo)準(zhǔn)對該咖啡豆進行評分，如下表5所示，該咖啡得到了81.25的高評分。

78、表5不同實施例感官評分得分結(jié)果

79、

80、

81、進一步地，本發(fā)明的第四目的是經(jīng)過所述的發(fā)酵方法得到一種玫瑰風(fēng)味咖啡，這是一款具有明顯的玫瑰花香，有著黃糖般的甜感、柔和的酸質(zhì)中帶著回甘，且有著杏仁、巧克力、堅果的調(diào)性，從高溫到低溫均能感受到迷人的玫瑰花香的發(fā)酵咖啡，品鑒評分為81.25分。

82、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明采用直接添加可食用玫瑰花，咖啡生豆與玫瑰花在發(fā)酵菌的作用下共同發(fā)酵，賦予咖啡生豆玫瑰風(fēng)味，有效解決了現(xiàn)有咖啡自然發(fā)酵導(dǎo)致咖啡風(fēng)味不可控、咖啡品質(zhì)均一性和穩(wěn)定性較差以及采用咖啡鮮果發(fā)酵不易保藏、咖啡鮮果的季節(jié)性對發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化形成制約的技術(shù)問題；以云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢微生物為發(fā)酵菌，咖啡生豆為原材料，制成特定風(fēng)味的咖啡豆，具有可持續(xù)性和穩(wěn)定性；增加的風(fēng)味通過生物轉(zhuǎn)化與咖啡原有風(fēng)味相融合，無分離感；降低苦味和澀味，風(fēng)味平衡，口感柔和。以此方法為依據(jù)，可將其他發(fā)酵食品中優(yōu)勢產(chǎn)香微生物應(yīng)用于咖啡發(fā)酵，使特定風(fēng)味咖啡豆具有可持續(xù)性和產(chǎn)品穩(wěn)定性。

83、具體地，本發(fā)明所述一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，在發(fā)酵過程中添加經(jīng)過紫外殺菌的玫瑰花瓣，使玫瑰的芳香化合物滲透到咖啡豆中。通過二次發(fā)酵，玫瑰香氣與咖啡風(fēng)味充分融合，形成獨特的玫瑰風(fēng)味咖啡。通過選擇性發(fā)酵和控制接菌濃度，確保發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味化合物一致，從而實現(xiàn)穩(wěn)定的風(fēng)味表現(xiàn)。

84、具體地，本發(fā)明所述一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，在發(fā)酵階段使用特定的菌懸液(接菌濃度為6～7lgcfu/ml)和恒溫恒濕的發(fā)酵條件，確保發(fā)酵過程的可控性和重復(fù)性，提高產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。通過設(shè)定明確的發(fā)酵時間(初次發(fā)酵24h，二次發(fā)酵48～60h)，確保每批次咖啡豆在最佳發(fā)酵時間內(nèi)達(dá)到理想的風(fēng)味和質(zhì)量。

85、具體地，本發(fā)明所述一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，在預(yù)處理階段通過高溫滅菌(105～115℃，5～10min)和紫外殺菌處理玫瑰花瓣，顯著降低了雜菌和病原菌的風(fēng)險，確保發(fā)酵過程和最終產(chǎn)品的安全性。采用特定濃度的發(fā)酵菌株，排除有害微生物污染，降低了發(fā)酵過程中有害菌生長的風(fēng)險，提高了產(chǎn)品的安全性和穩(wěn)定性。

86、具體地，本發(fā)明所述一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，使用已活化的特定發(fā)酵菌株(如馬克斯克魯維酵母)，優(yōu)化發(fā)酵過程，提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵時間，保證生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。在發(fā)酵過程中保持適宜的溫度(28±2℃)和濕度(相對濕度85％以上)，為發(fā)酵菌體提供最佳生長環(huán)境，確保高效的發(fā)酵過程。

87、具體地，本發(fā)明所述一種玫瑰風(fēng)味咖啡的發(fā)酵方法，從咖啡豆挑選、復(fù)水、滅菌、接菌、發(fā)酵到后續(xù)處理(豆花分離、干燥)，整個工藝流程清晰、系統(tǒng)化，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作和大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。每個步驟的操作條件明確，便于實際生產(chǎn)中執(zhí)行和控制，減少工藝波動和操作失誤。