本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)領域，具體涉及一種用于小鼠腎類器官的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術：

1、類器官(organoids)是一種在體外3d培養(yǎng)條件下，利用成體干細胞、胚胎干細胞或誘導多能干細胞自組裝誘導生成的具有三維空間結構的“迷你器官”，具有類似真實器官的復雜結構及多種細胞類型，并能最大限度模擬來源組織或器官的生理病理狀態(tài)。

2、目前腎臟類器官大多數(shù)是由多能干細胞誘導分化而成，包括腎單位類器官和輸尿管/集合管類器官。例如cn117070440a專利公開了一種高效構建人腎臟類器官的方法，該方法是基于hpscs誘導腎類器官，由多能胚胎干細胞(es)及其人工誘導多能干細胞(ipsc)誘導的類器官，這種方法存在費時費力，技術需求較高，分化方向存在一定的不可控性、基因組穩(wěn)定性較差，無法進一步增殖等缺點；同時ipsc衍生的類器官類似于人類腎臟發(fā)育的早期階段，含有非腎臟細胞類型，不是模擬成人疾病或研究潛在再生療法的理想系統(tǒng)。cn105378062a專利公開了包含分離和培養(yǎng)src+腎細胞群來源類器官及其用途，該方法需要先通過流式或磁珠分選出src+腎細胞群，然后培養(yǎng)為類器官，制備過程較為繁瑣，且缺少腎小球細胞。cn116218762a專利公開了一種腎小管類器官培養(yǎng)基及腎小管類器官的培養(yǎng)方法，該方法制備的是腎小管類器官，缺少腎小球細胞。

3、目前暫未見基于腎臟組織來源原代細胞制備包含多種腎臟組織細胞類型(包括近端腎小管、髓袢、遠端腎小管和腎小球)的小鼠腎類器官培養(yǎng)方法。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術問題，本發(fā)明包括以下幾個方面：

2、本發(fā)明的第一方面提供一種小鼠腎類器官的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：

3、(1)從小鼠腎臟組織提取原代細胞，制備成體干細胞；

4、(2)將步驟(1)得到的成體干細胞分散在擴增培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的混合液中，孵育，直至混合液凝固；

5、(3)加入擴增培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天，傳代后繼續(xù)在擴增培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2-4天；

6、(4)將擴增培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)11-14天，得到小鼠腎類器官；

7、所述小鼠腎類器官包含近端腎小管細胞、髓袢細胞、遠端腎小管細胞和腎小球細胞。

8、優(yōu)選的，所述小鼠腎臟組織為c57bl/6小鼠腎臟組織。

9、優(yōu)選的，所述步驟(1)中制備成體干細胞的具體方法如下：

10、(i)收集組織：處死小鼠，解剖，將分離的腎臟放入基礎培養(yǎng)基中；

11、(ii)修剪組織：去掉脂肪等其他組織；

12、(iii)消化組織：加入膠原酶iv，置于搖床中消化；

13、(iv)鏡檢：用移液器上下吹打10-20次促進組織破碎，鏡檢是否存在導管結構，如果沒有則繼續(xù)消化；

14、(v)終止消化：加入洗滌培養(yǎng)基重懸終止消化，70μm細胞篩網(wǎng)過濾，離心去上清，剩余沉淀物即為包含成體干細胞的原代細胞。

15、優(yōu)選的，所述步驟(i)中的基礎培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-鏈霉素混合液和y-27632。

16、更優(yōu)選的，所述步驟(i)中的基礎培養(yǎng)基包含advanceddmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-鏈霉素混合液和5-20μm?y-27632。以上組分含量百分比均為體積百分比。

17、進一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中的基礎培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液和10μm?y-27632。以上組分含量百分比均為體積百分比。

18、優(yōu)選的，所述步驟(v)中加入的洗滌培養(yǎng)基為含1％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的高糖dmem培養(yǎng)基。以上組分含量百分比均為體積百分比。

19、優(yōu)選的，所述步驟(2)和(3)中的擴增培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-鏈霉素混合液、慶大霉素、兩性霉素b、包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、n-乙酰半胱氨酸、b27?supplement、a83-01、egf、fgf-10和y-27632。

20、更優(yōu)選的，所述步驟(2)和(3)中的擴增培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-鏈霉素混合液、10-50μg/ml慶大霉素、20-100μg/ml兩性霉素b、30-50％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、0.5-2mm?n-乙酰半胱氨酸、0.5-3％b27?supplement、1-10μm?a83-01、20-100ng/ml?egf、50-200ng/ml?fgf-10和5-20μm?y-27632。以上組分含量百分比均為體積百分比。

21、進一步優(yōu)選的，所述步驟(2)和(3)中的擴增培養(yǎng)基包含advanceddmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、20μg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、1.25mm?n-乙酰半胱氨酸、1.5％b27?supplement、5μm?a83-01、50ng/ml?egf、100ng/ml?fgf-10和10μm?y-27632。以上組分含量百分比均為體積百分比。

22、進一步優(yōu)選的，所述步驟(2)和(3)中的擴增培養(yǎng)基由advanced?dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、20μg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、1.25mm?n-乙酰半胱氨酸、1.5％b27?supplement、5μm?a83-01、50ng/ml?egf、100ng/ml?fgf-10和10μm?y-27632組成。以上組分含量百分比均為體積百分比。

23、優(yōu)選的，所述包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i的制備方法如下：

24、(a)將5*107個l-wrn細胞接種于15cm培養(yǎng)皿，添加25-30ml培養(yǎng)基；

25、(b)培養(yǎng)60～72h后收集第1批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新鮮的培養(yǎng)基，上清于4℃保存；

26、(c)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第2批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新的培養(yǎng)基；

27、(d)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第3批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，所有條件培養(yǎng)基合并混勻分裝后保存于-80℃。

28、優(yōu)選的，所述步驟(a)中的培養(yǎng)基包含dmem/f12、10％fbs和1％青霉素-鏈霉素混合液。

29、優(yōu)選的，所述步驟(2)中的基質(zhì)膠為matrigel。

30、優(yōu)選的，所述步驟(2)中擴增培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的體積比為1:1。

31、優(yōu)選的，所述步驟(2)包括以下步驟：

32、(i)將成體干細胞分散在擴增培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的混合液中；

33、(ii)將成體干細胞、擴增培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的混合物滴在細胞培養(yǎng)板中；

34、(iii)將培養(yǎng)板在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，直至混合液凝固。

35、優(yōu)選的，所屬步驟(iii)中將培養(yǎng)板倒扣于37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育20-30min，直至混合液凝固。

36、優(yōu)選的，所述步驟(3)中的擴增培養(yǎng)基加入前置于37℃水浴中孵育。

37、優(yōu)選的，所述步驟(3)中的擴增培養(yǎng)基每2-3天更換一次。

38、優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含芳香維甲酸、醋酸氟氫可的松和佛司可林。

39、更優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含a83-01、包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、芳香維甲酸、醋酸氟氫可的松和佛司可林。

40、進一步優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-鏈霉素混合液、包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、a83-01、芳香維甲酸、醋酸氟氫可的松和佛司可林。

41、優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含1-5μm芳香維甲酸、5-20μm醋酸氟氫可的松和5-20μm佛司可林。

42、更優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含3μm芳香維甲酸、10μm醋酸氟氫可的松和10μm佛司可林。

43、優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含1-10μm?a83-01、30-50％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、1-5μm芳香維甲酸、5-20μm醋酸氟氫可的松和5-20μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

44、更優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含5μm?a83-01、40％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、3μm芳香維甲酸、10μm醋酸氟氫可的松和10μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

45、優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-鏈霉素混合液、1-10μm?a83-01、30-50％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、1-5μm芳香維甲酸、5-20μm醋酸氟氫可的松和5-20μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

46、更優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基包含advanceddmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、5μm?a83-01、40％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、3μm芳香維甲酸、10μm醋酸氟氫可的松和10μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

47、優(yōu)選的，所述包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii的制備方法如下：

48、(a)將5*107個lwnt-3a細胞接種于15cm培養(yǎng)皿，添加25-30ml培養(yǎng)基；

49、(b)培養(yǎng)60～72h后收集第1批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新鮮的培養(yǎng)基，上清于4℃保存；

50、(c)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第2批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新的培養(yǎng)基；

51、(d)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第3批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，所有條件培養(yǎng)基合并混勻分裝后保存于-80℃。

52、優(yōu)選的，所述步驟(a)中的培養(yǎng)基包含dmem/f12、10％fbs和1％青霉素-鏈霉素混合液。

53、優(yōu)選的，所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基每2-3天更換一次。

54、本發(fā)明的第二方面提供一種用于培養(yǎng)小鼠腎類器官的培養(yǎng)基組合物，所述培養(yǎng)基組合物包含擴增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，所述擴增培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-鏈霉素混合液、慶大霉素、兩性霉素b、包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、n-乙酰半胱氨酸、b27?supplement、a83-01、egf、fgf-10和y-27632，所述分化培養(yǎng)基包括advanced?dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-鏈霉素混合液、包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、a83-01、芳香維甲酸、醋酸氟氫可的松和佛司可林。

55、優(yōu)選的，所述擴增培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-鏈霉素混合液、10-50μg/ml慶大霉素、20-100μg/ml兩性霉素b、30-50％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、0.5-2mm?n-乙酰半胱氨酸、0.5-3％b27?supplement、1-10μm?a83-01、20-100ng/ml?egf、50-200ng/ml?fgf-10和5-20μm?y-27632；所述分化培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-鏈霉素混合液、1-10μm?a83-01、30-50％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、1-5μm芳香維甲酸、5-20μm醋酸氟氫可的松和5-20μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

56、更優(yōu)選的，擴增培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、20μg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、1.25mmn-乙酰半胱氨酸、1.5％b27?supplement、5μm?a83-01、50ng/ml?egf、100ng/ml?fgf-10和10μm?y-27632；所述分化培養(yǎng)基包含advanced?dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、5μm?a83-01、40％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、3μm芳香維甲酸、10μm醋酸氟氫可的松和10μm佛司可林。以上組分含量百分比均為體積百分比。

57、進一步優(yōu)選的，擴增培養(yǎng)基由advanceddmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、20μg/ml慶大霉素、50μg/ml兩性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i、1.25mmn-乙酰半胱氨酸、1.5％b27?supplement、5μm?a83-01、50ng/ml?egf、100ng/ml?fgf-10和10μm?y-27632組成；所述分化培養(yǎng)基由advanced?dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-鏈霉素混合液、5μm?a83-01、40％包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii、3μm芳香維甲酸、10μm醋酸氟氫可的松和10μm佛司可林組成。以上組分含量百分比均為體積百分比。

58、優(yōu)選的，所述包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基i的制備方法如下：

59、(a)將5*107個l-wrn細胞接種于15cm培養(yǎng)皿，添加25-30ml培養(yǎng)基；

60、(b)培養(yǎng)60～72h后收集第1批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新鮮的培養(yǎng)基，上清于4℃保存；

61、(c)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第2批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新的培養(yǎng)基；

62、(d)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第3批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，所有條件培養(yǎng)基合并混勻分裝后保存于-80℃。

63、優(yōu)選的，所述步驟(a)中的培養(yǎng)基包含dmem/f12、10％fbs和1％青霉素-鏈霉素混合液。

64、優(yōu)選的，所述包含wnt-3a的條件培養(yǎng)基ii的制備方法如下：

65、(a)將5*107個lwnt-3a細胞接種于15cm培養(yǎng)皿，添加25-30ml培養(yǎng)基；

66、(b)培養(yǎng)60～72h后收集第1批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新鮮的培養(yǎng)基，上清于4℃保存；

67、(c)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第2批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，補充新的培養(yǎng)基；

68、(d)繼續(xù)培養(yǎng)36～48h后收集第3批條件培養(yǎng)基，2000g/10min離心取上清，所有條件培養(yǎng)基合并混勻分裝后保存于-80℃。

69、優(yōu)選的，所述步驟(a)中的培養(yǎng)基包含dmem/f12、10％fbs和1％青霉素-鏈霉素混合液。

70、本發(fā)明的第三方面提供上述培養(yǎng)基組合物在培養(yǎng)小鼠腎類器官方面的應用，所述小鼠腎類器官包含近端腎小管細胞、髓袢細胞、遠端腎小管細胞和腎小球細胞。

71、本發(fā)明的第四方面提供上述分化培養(yǎng)基在促進小鼠腎類器官細胞分化方面的應用，所述小鼠腎類器官細胞同時分化為近端腎小管細胞、髓袢細胞、遠端腎小管細胞和腎小球細胞中的一種或多種。

72、優(yōu)選的，所述小鼠腎類器官細胞同時分化為近端腎小管細胞、髓袢細胞、遠端腎小管細胞和腎小球細胞。

73、優(yōu)選的，所述小鼠腎類器官細胞同時分化為遠端腎小管細胞和腎小球細胞。

74、本發(fā)明產(chǎn)生的技術效果：

75、1、與目前大多數(shù)技術采用的ipsc來源腎類器官相比，本發(fā)明采用成體干細胞制備的腎類器官具有以下優(yōu)點：(1)干細胞來源更易獲得；(2)制備的腎類器官更成熟，更接近發(fā)育完全的腎臟組織，更適合用于成體疾病的研究；(3)制備的腎類器官細胞種類更單一，完全由腎臟細胞組成而不包含其他細胞。

76、2、本發(fā)明創(chuàng)造性的采用擴增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基分兩個階段進行腎類器官培養(yǎng)，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明選擇的分化培養(yǎng)基可以促進腎臟多種細胞類型的全面分化，包括同時分化出近端腎小管細胞、髓袢細胞、遠端腎小管細胞和腎小球細胞等。

77、3、noggin、wnt-3a和r-spondin?3等添加因子價格昂貴，且不同批次間的質(zhì)量不一致。本發(fā)明通過使用l-wrn細胞系產(chǎn)生包含wnt-3a、r-spondin?3和noggin的條件培養(yǎng)基，使用lwnt-3a細胞系產(chǎn)生wnt-3a的條件培養(yǎng)基，該培養(yǎng)方法成本更低，一致性更高，可以提高小鼠腎類器官培養(yǎng)的成功率和生長速度。