本發(fā)明公開一種基于rpa-pfago的賈第蟲可視化檢測(cè)系統(tǒng)及其應(yīng)用，具體涉及一種利用rpa-pfago體系快速可視化檢測(cè)糞便中十二指腸賈第蟲的方法，屬于分子生物學(xué)檢測(cè)。

背景技術(shù)：

1、賈第蟲病是由十二指腸賈第蟲（ giardia?duodenalis）引起的一種常見的人畜共患寄生蟲病，在全球范圍內(nèi)引起重大公共衛(wèi)生關(guān)注。迄今為止，尚無有效疫苗可預(yù)防賈第蟲病，已有甲硝唑、替硝唑、阿苯達(dá)唑等治療賈第蟲病的藥物，但賈第蟲耐藥問題日益突出。因此，建立一套高效、靈敏和準(zhǔn)確的賈第蟲病檢測(cè)技術(shù)對(duì)于賈第蟲病的防控十分重要。

2、目前，對(duì)賈第蟲的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查主要通過傳統(tǒng)的鏡檢和巢式pcr。鏡檢包囊是賈第蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，通過懸浮法富集糞便中的包囊，碘液染色涂片后顯微鏡下觀察，這種方法雖然簡(jiǎn)單便捷，但是對(duì)人員專業(yè)技能要求高，主觀性強(qiáng)，極易出現(xiàn)漏檢等問題。利用巢式pcr可以擴(kuò)增多個(gè)靶基因，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，可以將賈第蟲分為a-h?八個(gè)分離株，但是這種方法僅限于實(shí)驗(yàn)室的診斷，需要昂貴的設(shè)備儀器。因此，開發(fā)一種便捷靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防和控制賈第蟲的人-動(dòng)物傳播具有重要的公共衛(wèi)生和獸醫(yī)學(xué)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了能夠高效、準(zhǔn)確、靈敏、便捷地檢測(cè)賈第蟲病提供了一種基于rpa擴(kuò)增結(jié)合pfago體系的快速可視化診斷賈第蟲病的引物、試劑盒以及檢測(cè)方法，本發(fā)明可以通過熒光定量pcr儀器讀取熒光值進(jìn)行分析，也可以通過藍(lán)光激發(fā)后根據(jù)熒光亮度直接判斷結(jié)果，極大降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的依賴性，同時(shí)減少了操作的步驟，有效避免了氣溶膠污染的出現(xiàn)。

2、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種檢測(cè)賈第蟲病的試劑。

3、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種診斷試劑盒。

4、本發(fā)明第三方面目的，在于提供一種基于rpa-pfago的賈第蟲可視化檢測(cè)系統(tǒng)及其應(yīng)用。

5、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

6、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種針對(duì)rpa-pfago檢測(cè)賈第蟲病的試劑，所述檢測(cè)試劑為一對(duì)rpa引物和ssdna；

7、所述引物序列分別為：

8、rpa-f7:?5’?-?caggctcatccagacggagtcgaggaagcgc-?3’；

9、rpa-r7:?5’?-?tgagtgtgtcgcccatctccgcaagggactt?-?3’；

10、所述ssdna核苷酸序列如下：

11、5‘-caggctcatccagacggagtcgaggaagcgccaggcctcgttcgaggacatccgcgagg-?3’

12、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種含有本發(fā)明第一方面的試劑盒。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方法中，所述試劑盒還包括gdna、pfago蛋白和分子探針。

14、所述gdna的序列是：

15、gdna2:?5‘-acgaggcctggcgctt-?3’，其中5‘被磷酸化修飾；

16、gdna2-2:?5‘-ctcctcgcggatgtcc-?3’，其中5‘被磷酸化修飾；

17、gdna2-3:?5‘-gaggaagcgccaggcc-?3’，其中5‘被磷酸化修飾；

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方法中，所述gdna切割rpa產(chǎn)物生成的單鏈gdna用于切割探針。所述分子探針5‘端修飾fam熒光基團(tuán)，3’端修飾bhq淬滅基團(tuán)。

19、所述分子探針mb-1的序列為：

20、mb-1?6?fam-cgcacccctcgaacgaggcctgggtgcg-bhq?1；

21、mb-1分子探針可以通過熒光定量pcr儀采集終點(diǎn)熒光強(qiáng)度或者在藍(lán)光激發(fā)時(shí)直接觀察結(jié)果。

22、在本發(fā)明的一些實(shí)施方法中，所述試劑盒包括rpa反應(yīng)緩沖液和pfago反應(yīng)緩沖液。

23、本發(fā)明的第三個(gè)方面，還提供一種針對(duì)賈第蟲病的rpa-pfago檢測(cè)系統(tǒng)，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括本發(fā)明第一方面的試劑和/或本發(fā)明第二方面的試劑盒；具體檢測(cè)方法的具體步驟如下：

24、（1）提取樣品糞便基因組；

25、（2）利用rpa擴(kuò)增本發(fā)明涉及的試劑盒和引物對(duì)步驟（1）的樣品糞便基因組進(jìn)行rpa反應(yīng)，反應(yīng)條件為39℃、30分鐘；

26、（3）將步驟（2）的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明涉及的rpa-pfago試劑盒混合，進(jìn)行pfago反應(yīng)，pfago濃度為2μm，gdna濃度為2μm，mb-1濃度為1.5μm；

27、（4）通過定量pcr儀讀取熒光信號(hào)或通過藍(lán)光激發(fā)判斷結(jié)果：當(dāng)反應(yīng)體系有熒光信號(hào)或發(fā)出熒光，則表示待測(cè)樣品含有賈第蟲，當(dāng)反應(yīng)體系無熒光信號(hào)或未發(fā)出熒光，則表示待測(cè)樣品不含有賈第蟲。

28、優(yōu)選地，步驟（2）所述的rpa反應(yīng)條件為39℃?30分鐘。

29、優(yōu)選地，步驟（3）所述pfago反應(yīng)體系中，pfago濃度為2μm，gdna濃度為2μm，mb-1濃度為1.5μm。

30、本發(fā)明的積極效果在于：

31、（1）本發(fā)明建立了一種新的rpa結(jié)合pfago的檢測(cè)方法。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，提高了rpa-pfago擴(kuò)增的效率、靈敏度和特異性；與目前廣泛應(yīng)用的crispr/cas9系統(tǒng)相比，整個(gè)操作過程更加簡(jiǎn)單，pfago和gdna的合成成本更低，且穩(wěn)定性更好，易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，更加適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；與傳統(tǒng)的巢式pcr相比，整個(gè)反應(yīng)僅需39℃的rpa擴(kuò)增和95℃的pfago切割反應(yīng)，通過水浴或金屬浴即可完成，不需要專業(yè)的溫控設(shè)備，根據(jù)使用的探針可以通過藍(lán)光激發(fā)直接觀察樣本中是否存在賈第蟲。

32、（2）本發(fā)明所提供的pfago蛋白，作為一種核酸內(nèi)切酶，可以在gdna引導(dǎo)下，靶向切割rpa擴(kuò)增產(chǎn)物，這一特性使得開蓋后造成氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。

33、（3）rpa-pfago系統(tǒng)極大的減少了所需的時(shí)間和設(shè)備成本，且該方法的試劑成分成本較低，易于保存，操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)人員專業(yè)性要求不高，更加適合現(xiàn)場(chǎng)的診斷。

技術(shù)特征：

1.一種針對(duì)rpa-pfago檢測(cè)賈第蟲病的試劑，其特征在于所述檢測(cè)試劑包括：一對(duì)rpa引物和ssdna；

2.一種基于rpa-pfago的賈第蟲可視化檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括：gdna、pfago蛋白和分子探針mb-1；

3.如權(quán)利要求2所述的一種基于rpa-pfago的賈第蟲可視化試劑盒的制備方法，包括rpa和pfago兩個(gè)組分，具體操作步驟如下：

4.pfago反應(yīng)組分包括：

5.一種針對(duì)賈第蟲病的rpa-pfago檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于包括權(quán)利要求1涉及的的試劑和權(quán)利要求2涉及的試劑盒；具體檢測(cè)方法的具體步驟如下：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種基于RPA?PfAgo的賈第蟲可視化檢測(cè)系統(tǒng)及其應(yīng)用，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，提高了RPA?PfAgo擴(kuò)增的效率、靈敏度和特異性；與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，整個(gè)操作過程更加簡(jiǎn)單，PfAgo和gDNA的合成成本更低，且穩(wěn)定性更好，易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，更加適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；整個(gè)反應(yīng)僅需39℃的RPA擴(kuò)增和95℃的PfAgo切割反應(yīng)，通過水浴或金屬浴即可完成，不需要專業(yè)的溫控設(shè)備，根據(jù)使用的探針可以通過藍(lán)光激發(fā)直接觀察樣本中是否存在賈第蟲，極大的減少了所需的時(shí)間和設(shè)備成本，操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)人員專業(yè)性要求不高，更加適合現(xiàn)場(chǎng)的診斷。

技術(shù)研發(fā)人員：李新,李超凡,李建華,張園園,王曉岑,張旭,張瀅,許玥琪,宮鵬濤,張楠,張西臣
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6