本發(fā)明涉及生物工程，尤其涉及一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

1、lp(a)由脂質(zhì)核心、載脂蛋白a(apolipoprotein，apoa)和apob100構(gòu)成，脂質(zhì)核心與ldl-c、apoa與纖溶酶原結(jié)構(gòu)上相似，因此，lp(a)可能具有致動脈粥樣硬化和促血栓形成的作用。lp(a)比ldl更容易致動脈粥樣硬化，且具有更長的血漿停留時間。循環(huán)lp(a)水平主要由編碼apoa的lpa基因決定，并且不受年齡、性別、運動、飲食和營養(yǎng)的影響。流行病學(xué)研究表明，lp(a)濃度升高與冠心病(coronaryheart?disease，chd)風(fēng)險增加相關(guān)。

2、lp(a)水平升高患者，心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險是正常人群的2～3倍。脂蛋白a升高易導(dǎo)致血管粥樣硬化，形成動脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致血管狹窄，影響心腦血管的供血。這種情況下，容易誘發(fā)心肌梗塞、心肌缺血、冠狀動脈供血不足、冠心病，以及腦血管狹窄、頸動脈狹窄等病癥。此外，lp(a)還可能增加腦血栓、腦梗塞的風(fēng)險，從而引起中風(fēng)。同于其它血脂，lp(a)水平主要由基因決定(>90％)，不能通過傳統(tǒng)的生活方式干預(yù)和他汀類藥物治療來改變。因此，lp(a)被視為比低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)更惡毒的“壞”膽固醇，也被證明是動脈粥樣硬化和主動脈瓣狹窄心血管疾病獨立危險因素。

3、lp(a)的檢測需要高純的lp(a)抗原及高性能的lp(a)抗體。目前，lp(a)主要通過天然提取和基因工程這兩種途徑獲得，因天然lp(a)來源困難，價格貴，同時在制備抗原過程中去除膽固醇，tg和載脂蛋白b等比較困難，因此人們越來越青睞于通過基因工程手段合成有活性的重組lp(a)，這樣不僅避免原料來源的限制，而且還能降低成本和可規(guī)?；a(chǎn)。優(yōu)質(zhì)lp(a)免疫原是制備優(yōu)質(zhì)lp(a)抗體的關(guān)鍵，目前l(fā)p(a)檢測實驗室多以免疫學(xué)方法為主，常用的檢測方法主要包括免疫透射比濁法(ita)、免疫散射比濁法(ina)、熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)等都需要特異性和靈敏度好的lp(a)抗體。為了讓眾多患者能得到很好的檢測與治療，研發(fā)低廉有活性的高純lp(a)及其高性能lp(a)多克隆抗體具有重大經(jīng)濟價值和積極的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，旨在生產(chǎn)低廉有活性的高純lp(a)及其高性能lp(a)多克隆抗體。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

3、以pet28a(+)為表達載體，將t7啟動子控制下的n-端融合了6個his標簽、trx標簽和pp酶酶切位點的lp(a)基因?qū)氪竽c桿菌進行誘導(dǎo)，再將其包涵體變性、復(fù)性后經(jīng)nifocurose?6ff柱純化，得到純度≥90％的lp(a)融合蛋白；

4、將lp(a)融合蛋白酶切及過ni?focurose?6ff柱純化，得到純度≥95％的不含標簽的lp(a)蛋白；

5、將純度≥95％的lp(a)蛋白對山羊進行免疫后，收集每次免疫后血清，經(jīng)過抗血清雙向瓊脂擴散實驗篩選合格血清，并使用proteina進行純化，獲得lp(a)多克隆抗體。

6、其中，所述大腸桿菌為ecoli?bl21(de3)。

7、其中，所述大腸桿菌發(fā)酵條件為按5％接種量將種子液接種至含有100ug/ml?kan的1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下擴大培養(yǎng)約1-2h，當od600上升至0.8時，加入iptg，使發(fā)酵液中iptg終濃度為0.5mm/l，放至18℃、220rpm的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)12-14h。

8、其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有胰蛋白胨15g/l、酵母粉25g/l、mgso40.6?g/l、na2hpo423?g/l、nah2po45?g/l和葡萄糖15g/l，ph為7.2。

9、本發(fā)明的一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，以pet28a(+)為表達載體，將t7啟動子控制下的n-端融合了6個his標簽、trx標簽和pp酶酶切位點的lp(a)基因?qū)氪竽c桿菌進行誘導(dǎo)，再將其包涵體變性、復(fù)性后經(jīng)ni?focurose?6ff柱純化，得到純度≥90％的lp(a)融合蛋白；將lp(a)融合蛋白酶切及過ni?focurose?6ff柱純化，得到純度≥95％的不含標簽的lp(a)蛋白；將純度≥95％的lp(a)蛋白對山羊進行免疫后，收集每次免疫后血清，經(jīng)過抗血清雙向瓊脂擴散實驗篩選合格血清，并使用proteina進行純化，獲得lp(a)多克隆抗體，該在大腸桿菌為ecoli?bl21(de3)中以pet23a(+)為表達載體，將選擇apoakiv1(20-130)段進行表達，兩端插入限制性酶切位點bamhi、ecori的基因片段，實現(xiàn)lp(a)融合蛋白包涵體表達。再將其包涵體變性、復(fù)性后經(jīng)過ni?focurose?6ff柱純化，得到純度≥90％的lp(a)融合蛋白，將lp(a)融合蛋白酶切及過ni?focurose?6ff柱純化，得到純度≥95％的不含標簽的lp(a)蛋白。本發(fā)明的高純重組lp(a)不僅具有活性，而且成本低廉，不受原料限制，可大規(guī)模生產(chǎn)，在臨床診斷、體外診斷方面具有潛在而廣泛的應(yīng)用價值，脂蛋白(a)多次免疫山羊，在每次免疫后進行采血，經(jīng)過雙向瓊脂擴散實驗篩選合格血清，經(jīng)抗原親和純化柱純化，得到高活性的lp(a)多克隆抗體，制備的lp(a)成本低廉，操作簡便，純度較高，不僅可以作為有效的免疫原，可用于的lp(a)多抗的制備；而且可以作為檢測試劑盒的校準品原料。本發(fā)明制備的抗體特異性好(分析靈敏度高)、線性范圍廣、檢測限低，在臨床診斷、體外診斷方面具有潛在而廣泛的應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，其特征在于，

3.如權(quán)利要求1所述的一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，其特征在于，

4.如權(quán)利要求3所述的一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，其特征在于，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人脂蛋白a及其多克隆抗體的制備方法，包括以pET28a(+)為表達載體，將T7啟動子控制下的N?端融合了6個His標簽、Trx標簽和PP酶酶切位點的Lp(a)基因?qū)氪竽c桿菌進行誘導(dǎo)，再將其包涵體變性、復(fù)性后經(jīng)Ni?Focurose?6FF柱純化，得到純度≥90％的Lp(a)融合蛋白；將Lp(a)融合蛋白酶切及過Ni?Focurose?6FF柱純化，得到純度≥95％的不含標簽的Lp(a)蛋白；將純度≥95％的Lp(a)蛋白對山羊進行免疫后，收集每次免疫后血清，經(jīng)過抗血清雙向瓊脂擴散實驗篩選合格血清，并使用ProteinA進行純化，獲得Lp(a)多克隆抗體，該方法的Lp(a)成本低廉純度較高，不僅可以作為有效的免疫原，用于的Lp(a)多抗的制備；而且可以作為檢測試劑盒的校準品原料。

技術(shù)研發(fā)人員：李林衡,宋心怡,熊露群,李建平,鄧珍琴
受保護的技術(shù)使用者：桂林英美特生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6