本發(fā)明涉及單克隆抗體及其制備方法，具體涉及一種抗大黃魚cd8α的單克隆抗體及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、硬骨魚類是一組具有經(jīng)典適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和原始t細(xì)胞的脊椎動(dòng)物，因此它們被認(rèn)為是研究t細(xì)胞免疫進(jìn)化的理想模型。與高等哺乳動(dòng)物相似，硬骨魚類t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中扮演著至關(guān)重要的角色，并主要由cd8+t細(xì)胞執(zhí)行，cd8+t細(xì)胞能增殖、分化為細(xì)胞毒性效應(yīng)t細(xì)胞，具有殺傷能力，其存在對(duì)于機(jī)體抵御病原體感染尤為重要。由于缺乏能特異性識(shí)別cd8+t細(xì)胞的單克隆抗體，對(duì)cd8+t細(xì)胞的了解主要來(lái)自哺乳動(dòng)物模型，而早期脊椎動(dòng)物中cd8+t細(xì)胞的功能及增殖、分化等免疫學(xué)相關(guān)機(jī)制在很大程度上仍不清楚。

2、cd8是cd8+t細(xì)胞的表面marker，有兩種形式，αα同源二聚體，αβ異源二聚體。因此，相較于cd8β，cd8α是cd8+t細(xì)胞的主要tcr共受體，在t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中發(fā)揮更重要的作用。([1]coledk,?gao?gf.?cd8:?adhesion?molecule,?co-receptor?and?immuno-modulator.?cell?mol?immunol.?2004?apr;1(2):81-8.?[2]moore?lj,?somamoto?t,?liekk,?dijkstra?jm,?hordvik?i.?characterisation?of?salmon?and?trout?cd8alpha?andcd8beta.?mol?immunol.?2005jun;42(10):1225-34.?)借助高質(zhì)量的抗大黃魚cd8α單克隆抗體，可以鑒定、分離出大黃魚cd8+t細(xì)胞，這為揭示硬骨魚類cd8+t細(xì)胞的功能及增殖、分化等免疫學(xué)相關(guān)機(jī)制提供了先決條件，對(duì)于理解硬骨魚類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的工作原理至關(guān)重要。此外，解析t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用機(jī)制有助于新的魚類疫苗的開(kāi)發(fā)，即通過(guò)增強(qiáng)魚體的細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)預(yù)防疾?。╗3]yamaguchi?t,takizawa?f,?furihata?m,?soto-lampev,?dijkstra?jm,?fischer?u.?teleost?cytotoxic?t?cells.?fish?shellfish?immunol.2019?dec;95:422-439.?）。所以，開(kāi)發(fā)抗大黃魚cd8α單克隆抗體，有助于闡明魚類cd8+t細(xì)胞的功能及相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制和新型疫苗的研發(fā)，對(duì)完善硬骨魚類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究和病害防控具有重要理論及現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、圖1：免疫熒光標(biāo)記的nih\3t3-lccd8α細(xì)胞。

2、圖2：流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗大黃魚cd8α單克隆抗體標(biāo)記的淋巴細(xì)胞；

3、圖a：同型一抗對(duì)照標(biāo)記的頭腎淋巴細(xì)胞樣品；圖b：抗大黃魚cd8α單克隆抗體標(biāo)記的頭腎淋巴細(xì)胞樣品。

4、圖3：免疫熒光標(biāo)記大黃魚淋巴細(xì)胞；

5、圖中藍(lán)色指示dapi標(biāo)記的細(xì)胞核，綠色指示抗大黃魚cd8α單克隆抗體特異性標(biāo)記的cd8+t淋巴細(xì)胞。

6、圖4：cd8+t細(xì)胞和cd8-t細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物的基因表達(dá)譜分析結(jié)果。其中，actin是內(nèi)參基因，cd3是t細(xì)胞的標(biāo)志物，cd4-1和cd4-2是cd4+t細(xì)胞的標(biāo)志物，cd8α和cd8β是cd8+t的細(xì)胞標(biāo)志物，igt是b細(xì)胞的標(biāo)志物；cd8+表示cd8+t細(xì)胞，cd8-表示cd8-t細(xì)胞。

技術(shù)特征：

1.抗大黃魚cd8α單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株cd8α-5e3，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：c2024283，保藏日期為2024年08月26日所分泌。

2.如權(quán)利要求1所述抗大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟（1）中制備nih\3t3-lccd8α穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的方法為：將表達(dá)載體pcdh-cmv-gfp-lccd8α、包裝載體pspax2和包膜載體pmd2.g一同轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞包裝得到lccd8α慢病毒；所得lccd8α慢病毒濃縮后感染nih\3t3細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)lccd8α的細(xì)胞株nih\3t3-lccd8α。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述轉(zhuǎn)染的體系為15μg表達(dá)載體pcdh-cmv-gfp-lccd8α、6μg包裝載體pspax2和3μg包膜載體pmd2.g加入到750μl無(wú)血清dmem培養(yǎng)基中，同時(shí)另取750μl無(wú)血清dmem培養(yǎng)基稀釋24μl?lipo8000脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑，再將兩者混合。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述lccd8α慢病毒濃縮的步驟為將轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞包裝得到lccd8α慢病毒上清與病毒濃縮液5*peg8000以4:1混合,4°c搖床過(guò)夜；所述嘌呤霉素濃度為5μg/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于：在步驟（2）中，制備雜交瘤細(xì)胞株cd8α-5e3的具體方法為：將nih\3t3-lccd8α細(xì)胞與無(wú)血清dmem培養(yǎng)基混合，作為抗原免疫balb/c小鼠，以骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生抗大黃魚cd8α單克隆抗體的小鼠脾細(xì)胞融合，得分泌抗大黃魚cd8α單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株cd8α-5e3。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述大黃魚cd8α單克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟（3）中制備抗大黃魚cd8α單克隆抗體的方法為將雜交瘤細(xì)胞株cd8α-5e3使用有限稀釋法和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法結(jié)合，篩選出分泌抗大黃魚cd8α單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株cd8α-5e3，進(jìn)而得到單克隆抗體。

8.如權(quán)利要求1所述的抗大黃魚cd8α單克隆抗體在特異性識(shí)別大黃魚cd8+?t細(xì)胞中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種一種抗大黃魚CD8α單克隆抗體及其制備方法，該單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株CD8α?5E3，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C2024283，保藏日期為2024年08月26日所分泌。此抗體特異性高，可用于鑒定、分離和研究大黃魚CD8<supgt;+</supgt;T細(xì)胞，這有助于揭示硬骨魚類CD8<supgt;+</supgt;T細(xì)胞的功能及細(xì)胞毒性作用相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制研究等，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：陳新華,賴國(guó)龍,吳怡楠子,丁揚(yáng),劉思暢
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2