本發(fā)明屬于但不限于植物生物技術和小麥分子育種，尤其涉及一種檢測小麥抗白粉病基因wtk4的功能分子標記及其應用。

背景技術：

1、小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌(blumeria?graminis?f.sp.tritici，bgt)引起的小麥真菌性病害，也是我國小麥生產上常發(fā)性重要病害之一，嚴重時可導致小麥減產30％-50％，嚴重危害我國的小麥生產。由于我國長期以來大面積種植抗性單一的小麥品種，導致小麥白粉菌產生了定向選擇，導致我國大多數(shù)抗性品種的抗性逐漸喪失。篩選和培育抗病小麥品種是防治小麥白粉病最基本和最有效的方法。

2、隨著測序技術的進步和分子生物技術的發(fā)展，雖然在小麥及其近種屬中已經定位了100多個(pm1-pm69)抗白粉病基因或qtls，但是大部分抗性基因資源未能夠得到充分的應用和推廣，通過傳統(tǒng)的育種方法，很難將小麥近緣物種中的優(yōu)異抗病基因應用到小麥育種中。與常規(guī)育種方法相比，分子標記輔助選擇技術在篩選和培育小麥抗病性品種進程中具有目的明確、縮短育種進程、提高選擇效率等許多優(yōu)點。但目前大部分抗病位點所用的分子標記均為連鎖分子標記，標記與抗病位點存在一定的距離，不同遺傳背景的小麥品種可能存在重組，僅靠連鎖分子標記追蹤會導致目標抗病位點的丟失，相比于傳統(tǒng)的連鎖分子標記，基因特異的分子標記存在基因內部與目標基因共分離，不存在重組現(xiàn)象，分子標記檢測不受材料類型和遺傳背景的影響，檢測結果可信度高，大大提高抗病基因的轉育利用。wtk4是來自節(jié)節(jié)麥的小麥抗白粉病基因，具有廣譜抗性且在六倍體人工合成小麥中仍然保持抗性，是小麥優(yōu)異的抗白粉病基因資源，目前wtk4尚未在小麥品種中應用，追蹤wtk4基因的分子標記尚未報道。

3、鑒于上述分析，現(xiàn)有技術存在的急需解決的技術問題為：

4、如何高效、準確的檢測和追蹤wtk4對小麥抗白粉病育種具有重要意義，而開發(fā)wtk4基因特異的功能分子標記顯得尤為迫切。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種檢測小麥抗白粉病基因wtk4的功能分子標記及其應用。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種檢測小麥抗白粉病基因wtk4的功能分子標記，其特征在于，所述indel分子標記為wtk4-indel，該標記是根據節(jié)節(jié)麥ciae8中wtk4基因與中國春中wtk4同源基因序列的差異，對第三個內含子區(qū)域866bp位置存在的105bp插入/缺失位點，開發(fā)了一個wtk4基因特異的indel分子標記，所述indel分子標記的引物核苷酸序列包括上游引物wtk4-indel-f和下游引物wtk4-indel-r。

3、進一步，所述檢測小麥抗白粉病基因wtk4的基因功能性分子標記，上下游引物核苷酸序列如下：

4、wtk4-indel-f：5’-gtgggtttttggagcagtgg-3’

5、wtk4-indel-r：5’-aataacgcacaaccataggca-3’

6、本發(fā)明另一目的在于提供一種檢測小麥白粉病抗性基因wtk4的基因功能性分子標記在鑒定小麥白粉病抗性中的應用，所述標記能夠特異的追蹤wtk4基因，并且能夠將wtk4基因型區(qū)分為中國春感病基因型和節(jié)節(jié)麥抗病基因型。

7、進一步，采用上述的分子標記對待測小麥的dna進行檢測，若pcr產物出現(xiàn)375bp的特異條帶，則表明待測樣品含有節(jié)節(jié)麥基因型的wtk4基因，并且具有白粉病抗性。若pcr產物擴出480bp的特異條帶，則表明待測小麥為中國春基因型的wtk4基因，不具有白粉病抗性。

8、進一步的，所述檢測方法包括以下步驟：

9、s1：利用ctab法提取待測樣本dna；

10、s2：用檢測引物對進行pcr擴增；

11、s3：對pcr產物進行電泳分析。

12、s4：上述鑒定方法中，步驟s2的pcr反應體系和擴增條件如下：

13、反應體系：每10μl包括：50ng/μl基因組dna?1.0μl，5μl?pcr?master?mix，

14、擴增條件：95℃預變性3分鐘；95℃變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸15秒，進行32個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

15、進一步，所述pcr產物用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，并用凝膠成像儀讀取條帶。

16、結合上述的技術方案和解決的技術問題，本發(fā)明所要保護的技術方案所具備的優(yōu)點及積極效果為：

17、第一、小麥白粉病抗性基因資源的高效利用，是培育抗病品種的關鍵。本發(fā)明開發(fā)的分子標記是基于已克隆基因wtk4的序列開發(fā)，屬于基因特異分子標記，相比于傳統(tǒng)的連鎖分子標記，基因特異的分子標記存在基因內部與目標基因共分離，不存在重組現(xiàn)象，分子標記檢測不受材料類型和遺傳背景的影響，檢測結果可信度高，大大提高了基因wtk4的轉育利用。

18、利用wtk4功能標記在385份小麥自然群體中進行擴增，僅有7份小麥品種含有wtk4，并且擴增帶型與中國春的擴增帶型一致，白粉病抗性鑒定結果顯示這7份普通小麥都高感白粉病。標記在94份節(jié)節(jié)麥品系中擴增結果顯示，有12份節(jié)節(jié)麥品系有條帶擴增，擴增條帶與ciae8的大小一致，白粉病抗性鑒定結果顯示這12份節(jié)節(jié)麥品系都高抗小麥白粉病。表明小麥抗白粉病基因wtk4在小麥種質資源中出現(xiàn)的頻率較低，未能夠在小麥育種中利用，是小麥優(yōu)異的抗病基因資源，該標記能夠特異的追蹤wtk4基因，屬于特異的功能分子標記，能夠準確快速的鑒定材料中是否含有wtk4基因，并且能夠通過擴增類型判斷材料的白粉病抗性，加快了基因wtk4的高效利用。

19、第二，本發(fā)明的技術方案填補了國內外業(yè)內技術空白：

20、wtk4是來自節(jié)節(jié)麥的抗小麥白粉病基因，具有廣譜抗性是小麥優(yōu)異的抗性基因資源，目前尚未在小麥抗病育種中進行利用，開發(fā)的wtk4基因特異分子標記能夠精準的鑒定wtk4基因和材料的白粉病抗性，極大的提高了wtk4在今后小麥抗病育種中的利用效率，填補了國內外缺少wtk4分子標記鑒定的行業(yè)空白。

21、第三，本發(fā)明的技術方案通過開發(fā)一種基于特異性分子標記wtk4-indel的小麥抗白粉病基因檢測方法，顯著解決了現(xiàn)有技術在抗病育種中的幾個關鍵問題。傳統(tǒng)的抗病性鑒定方法多依賴于長周期的表型觀察和環(huán)境條件的控制，費時費力，并且存在顯著的不確定性和低效性。而本發(fā)明通過基因組dna的分子檢測，直接在分子水平上識別小麥中是否攜帶抗病基因wtk4，提升了檢測速度、準確性和一致性。

22、技術上，本發(fā)明解決了現(xiàn)有育種檢測中由于白粉病抗病性狀的多態(tài)性而導致的判定困難的問題。通過特異性的wtk4-indel分子標記，本發(fā)明能夠精準區(qū)分攜帶抗病基因型(節(jié)節(jié)麥基因型)與感病基因型(中國春基因型)的小麥植株，避免了傳統(tǒng)檢測依賴的復雜表型測量過程。此外，本發(fā)明的標記檢測方法對于育種材料沒有依賴環(huán)境條件和生長期的限制，因此可廣泛適用于早期抗病育種篩選，解決了育種流程中早期判斷難、選育效率低的問題。

23、產業(yè)應用方面，本發(fā)明大幅縮短了抗病育種的周期，使得育種機構可以在短時間內對大量材料進行篩選，快速鎖定抗病基因型植株，顯著提高了抗病育種的效率與成功率。同時，使用本發(fā)明的標記方法可以在分子水平上提供抗病基因型數(shù)據，便于育種記錄和抗病基因資源的保存與利用，減少了人力和資源消耗。在抗病小麥的快速推廣上，本技術方案支持大規(guī)模種質資源的篩查，為小麥抗白粉病的產業(yè)化生產提供了穩(wěn)定可靠的技術保障。