本發(fā)明涉及分子生物，具體涉及一種可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術：

1、大頭金蠅(chrysomya?megacephala)是死亡現(xiàn)場出現(xiàn)頻率最高的，同時也是最先到達的嗜尸性蠅類之一，其種類鑒定的準確度和所需時間直接影響死亡時間推斷的精確性和速度。受限于形態(tài)學鑒定掌握困難，且對大多數(shù)幼蟲和蛹無效，法醫(yī)工作者更多依賴于dna-barcoding分子鑒定。但是分子鑒定依賴實驗室pcr設備，且目前常用的dna-barcoding方法需要進行測序和比對工作，鑒定耗時較長。尋找一種速度快、準確度高、能可視化，且具有現(xiàn)場應用價值的大頭金蠅種類鑒定技術十分必要。

2、重組酶聚合酶擴增技術(recombinase?polymerase?amplification,rpa)是一種恒溫核酸擴增技術，無需復雜設備即可在37℃～42℃完成指數(shù)級擴增，為基于分子手段的物種鑒定提供了新思路。與側(cè)流層析試紙條(lateral?flow?dipstick,lfd)結合能實現(xiàn)裸眼可視化檢測，非常適用于現(xiàn)場的檢測和分析。因此，本方法基于重組酶聚合酶擴增技術結合側(cè)流層析試紙可視化方法(rpa-lfd)，建立了大頭金蠅簡單、快速、高特異性和靈敏度的種類鑒定方法，可以促進法醫(yī)昆蟲學證據(jù)的基層推廣應用。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于目前存在的上述不足，本發(fā)明提供一種可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd引物、探針、試劑盒及方法，具有快速、簡單、準確等優(yōu)點。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供了以下技術方案。

3、第一方面，本發(fā)明提供了一對可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd的引物，所述引物的核苷酸序列為：

4、如seq?id?no：1所示的正向引物；其中，所述正向引物為：5'-taccatttattgttctagctgcacgtcgt-3'；

5、如seq?id?no：2所述的反向引物；其中，所述反向引物為：5'-[biotin]-ttgaatatgaactggagtaactaaaggatt-3'；

6、第二個方面，本發(fā)明提供了一對可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd的探針，所述探針的核苷酸序列為：

7、所述探針的核苷酸序列為：

8、如seq?id?no：3所述的探針；其中，所述探針為：5'-[fam]-attttattagtattaattaatccttacttac[tnf]ttggtgaccctg?ataat-[c3spacer]-3'。

9、第三個方面，本發(fā)明還提供了前述的引物及探針的組合。

10、第四個方面，本發(fā)明還提供了一種可視化快速檢測大頭金蠅的rp?a-lfd試劑盒，所述試劑盒保護前述的引物和探針。

11、進一步地，所述試劑盒還包括rpa擴增反應體系試劑。

12、進一步地，所述試劑盒還包括側(cè)流層析試紙條。

13、第五個方面，本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的大頭金蠅的rpa-lfd可視化快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

14、(1)提取待測樣本的dna；

15、(2)以步驟(1)提取的dna為模板，利用權利要求4～6任一所述的試劑盒進行rpa-lfd反應，得到rpa雙標記擴增子；

16、(3)應用側(cè)流層析試紙條對步驟(2)中的rpa雙標記擴增子進行可視化結果判定。

17、進一步地，所述rpa雙標記擴增子為帶有fam和biotin雙標記的擴增子。

18、進一步地，所述側(cè)流層析試劑條的檢測方法為：用去離子水將所述rpa雙標記擴增子進行40倍稀釋后混勻，滴入側(cè)流層析試紙加樣孔中，室溫靜置，5min內(nèi)觀察結果。

19、本發(fā)明的有益效果：

20、本發(fā)明基于cytb基因聯(lián)合使用rpa和lfd技術，構建了快速、準確的大頭金蠅種類鑒定可視化檢測體系。體系包括檢測大頭金蠅的引物對、探針，在37℃條件下僅需15min即可完成擴增，具有良好的特異性，靈敏度達7.8×10-4ng，對案件中的大頭金蠅樣本的陽性檢出率達100％。使用lfd進行可視化，檢測結果可在3min穩(wěn)定讀取，簡單且直觀?？偟膩碚f，本發(fā)明可在20min內(nèi)，實現(xiàn)從獲得樣本dna到可視化檢出結果的全過程。

技術特征：

1.一種可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd的引物和探針的組合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為：

2.一種可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權利要求1所述的引物和探針。

3.根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括rpa擴增反應體系試劑。

4.根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測大頭金蠅的rpa-lfd試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括側(cè)流層析試紙條。

5.一種非診斷目的的大頭金蠅的rpa-lfd可視化快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權利要求5所述的大頭金蠅的rpa-lfd可視化快速檢測方法，其特征在于，所述rpa雙標記擴增子為帶有fam和biotin雙標記的擴增子。

7.根據(jù)權利要求5所述的大頭金蠅的rpa-lfd可視化快速檢測方法，其特征在于，所述側(cè)流層析試劑條的檢測方法為：用去離子水將所述rpa雙標記擴增子進行40倍稀釋后混勻，滴入側(cè)流層析試紙加樣孔中，室溫靜置，5min內(nèi)觀察結果。

技術總結
本發(fā)明屬于分子生物學檢測領域，具體地，公開了一種可視化快速檢測大頭金蠅的RPA?LFD引物、探針、試劑盒及方法，引物序列如SEQ?ID?NO：1～2所示，探針序列如SEQ?ID?NO：3所示。本發(fā)明提供的引物和探針的組合物，通過RPA?LFD技術，可以在20min內(nèi)，實現(xiàn)從獲得樣本DNA到可視化檢出結果的全過程。本發(fā)明提供的一種可視化快速檢測大頭金蠅的RPA?LFD引物、探針、試劑盒及方法，具有特異性高、靈敏度好、檢出率高等優(yōu)點。

技術研發(fā)人員：郭亞東,楊鳳芹,文丹,唐萱,葉承鑫
受保護的技術使用者：中南大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/26