本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測和海藻遺傳育種，具體涉及用于鑒定壇紫菜雌雄性別的分子標(biāo)記和方法。

背景技術(shù)：

1、紫菜(pyropia/porphyra?spp.)因味道鮮美、營養(yǎng)價值高，被人們廣泛食用，在中日韓三國被大規(guī)模栽培。紫菜栽培不僅產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)價值，而且對栽培海區(qū)的生態(tài)修復(fù)具有重要作用。目前，在我國被大規(guī)模人工栽培的紫菜有壇紫菜(pyropia?haitanensis)和條斑紫菜(pyropia?yezoensis)，前者主要被栽培在福建、浙江和廣東三省，后者被栽培于江蘇和山東二省。2023年，我國紫菜產(chǎn)業(yè)規(guī)模達(dá)6.4萬公頃，年產(chǎn)量21.0萬噸，居世界首位，其中壇紫菜的產(chǎn)量約占全國紫菜總產(chǎn)量的75％。

2、壇紫菜的生活史由微型的絲狀孢子體(2n)和大型的葉狀配子體(n)兩個異型世代組成：葉狀體成熟后形成雌性(果胞)和雄性(精子)生殖細(xì)胞，通過有性生殖產(chǎn)生果孢子，果孢子萌發(fā)成絲狀體，后者成熟后放散出殼孢子并萌發(fā)成葉狀體。利用顏色突變體與野生型葉狀體的雜交實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)壇紫菜殼孢子萌發(fā)的最初兩次分裂為減數(shù)分裂，其性別由1對等位基因決定并在減數(shù)分裂中分離，所以有性生殖的后代葉狀體為雌雄同體(zhang?y,yanxh,aruga?y.the?sex?and?sex?determination?in?pyropia?haitanensis(bangiales,rhodophyta).plos?one,2013,8:e73414)。此外，壇紫菜單離體細(xì)胞再生的葉狀體，無論是雌性或雄性，均可發(fā)生單性生殖，通過染色體自然加倍，產(chǎn)生遺傳上完全純合的絲狀體，后者的子代葉狀體是單性且可育的(嚴(yán)興洪,李琳,陳俊華,有賀佑勝.壇紫菜的單性生殖與遺傳純系分離.高技術(shù)通訊,2007,17(2):205-210)。

3、在通常情況下，壇紫菜的雄性葉狀體成熟較早，而雌性葉狀體成熟相對較晚。另外，葉狀體成熟早晚直接會影響紫菜產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，至今目前所選育的壇紫菜優(yōu)良品種，其子代葉狀體性別多為雌性。但在育種過程中，只有在葉狀體成熟后才能鑒定其性別，相對會拖慢育種進(jìn)程。此外，在壇紫菜雜交育種時，雜合果孢子與果胞孤雌生殖時均可萌發(fā)形成絲狀體，因而不能區(qū)分所挑選的絲狀體是雜合絲狀體還是純合絲狀體，只能根據(jù)子代葉狀體中是否出現(xiàn)嵌合葉狀體進(jìn)行確認(rèn)，耗時耗力。因此，尋求早期鑒定性別的方法，對加速壇紫菜的育種速度具有較大價值。

4、目前，性別特異性分子標(biāo)記可用于對生物的遺傳性別進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定，已在許多經(jīng)濟(jì)動植物上開發(fā)出性別相關(guān)的dna分子標(biāo)記，例如大黃魚(larimichthys?crocea)、半滑舌鰨(cynoglossus?semilaevis)、蘆筍(asparagus?officinalis)、海帶(saccharinajaponica)和龍須菜(gracilariopsis?lemaneiformis)等。但迄今為止，仍缺乏有效鑒別壇紫菜遺傳性別的分子標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種可快速、準(zhǔn)確地鑒定壇紫菜雌雄性別的分子標(biāo)記和方法。

2、本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供一種用于鑒定壇紫菜雌性性別的分子標(biāo)記，其包括雌性分子標(biāo)記和雄性分子標(biāo)記；其中：

4、所述雌性分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，具體為：ctgcggctgttgctgttctgacaagttgctccgtatggattggttgtgtctctcctcctggcccctcgcttgtctccctctgtacactcatgcagccatgggcatctgcgtcaccatcctcaagcgacgttgccgttccgtaggcatccacgcttggccgtaccgaaagatggccatggttgagaagaggattcagctgcgcgagacgatgctcttggatggtagcgccgagcttactgatgactcgtctgaggcgctcagggcggagatatccgagctgaagctccgtatggatctgcttcggaagaatccgaacttgaagtcaagcgacctggtctgaggtatgcctatgaccgtgttctgaacctcatgcttctgtgagtgtctatttattctccgctctcagcctgtctatctgagtggctatgaaattttggcaaacaaggcgtgtacaaagtactccgccaaggcatga；

5、所述雄性分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no:4所示，具體為：actcatgcacgtcctcccttgccgacgcgacgggcgagcggtagcaacaggacgacgggacgcgcgcccaccagcacaaagcggcgcgggtgcgctggcgcgggctccaccgaggccccctcgggcagtgacccaccttgtgcgcgccatcaccctcggattcatgcccgtcaaaggccaccccactcgagcgggcgtcgggaggggcggttggggacgacgaggaacacccggtcgagcccgtgcgctaattgccttcggatgcgtgcgtggcagcgtcagcggtcgccccacggaccgcaaagaccgtcgctctcctacactgccccctcacctctcacccccccccgcccaccccgttcctcgctttcccgctcgacgaattttgccgcgacctcgccgcgacggcggctgctgcggcggctttcgccgccgggccttgcctgacctggacgacttcgctgtcgtcgtggccgttggtcgaggtactcccgtctgccgctgccgccgtcgccgccgccgccaccgttgtttgcgtacgtgccacggaagctgccgtatccttcagatctgccgccacagactttccaaccgag。

6、作為優(yōu)選，擴(kuò)增所述雌性分子標(biāo)記的引物phf1的序列如seq?id?no:2和seq?idno:3所示，具體為：

7、f：ctgcggctgttgctgttc(seq?id?no:2)；

8、r：tcatgccttggcggagta(seq?id?no:3)。

9、作為優(yōu)選，擴(kuò)增所述雄性分子標(biāo)記的引物phm1的序列如seq?id?no:5和seq?idno:6所示，具體為：

10、f：actcatgcacgtcctccctt(seq?id?no:5)；

11、r：ctcggttggaaagtctgtgg(seq?id?no:6)。

12、本發(fā)明還提供擴(kuò)增所述雌性分子標(biāo)記的引物或者所述引物phf1在鑒定壇紫菜雌性或雜交品系中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供擴(kuò)增所述雄性分子標(biāo)記的引物或者所述引物phm1在鑒定壇紫菜雄性或雜交品系中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供一種用于鑒定壇紫菜雌雄性別的方法，包括如下步驟：

15、(1)提取壇紫菜的絲狀體或葉狀體基因組dna；

16、(2)使用所述引物phf1和引物phm1分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

17、(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測；

18、1)若只能在引物phf1擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測到一條長度為475bp的特異性條帶，則判斷該壇紫菜絲狀體是純合的，其子代葉狀體為雌性；

19、2)若只能在引物phm1擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測到一條長度為596bp的特異性條帶，則判斷該壇紫菜絲狀體是純合的，其子代葉狀體為雄性；

20、3)若在引物phf1和引物phm1擴(kuò)增產(chǎn)物中分別可檢測到一條長度為475bp和596bp的特異性條帶，則判斷該壇紫菜絲狀體為雜合的，其子代葉狀體為雌雄同體。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

22、(1)本發(fā)明采用dna分子標(biāo)記技術(shù)鑒定壇紫菜雌雄性別，只需兩次簡單的pcr擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳即可鑒別壇紫菜葉狀體雌雄性別，并可區(qū)分純合和雜合絲狀體，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，且不受環(huán)境因素影響。

23、(2)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記具有檢測結(jié)果穩(wěn)定、操作快捷、穩(wěn)定性好和檢測成本低廉等優(yōu)勢，用于鑒別壇紫菜葉狀體雌雄性別，在生物學(xué)檢測和海藻遺傳育種領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。