本發(fā)明屬于基因工程或生物，具體涉及高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric?acid；gaba）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，在微生物、植物和動物體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能。gaba在醫(yī)藥食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，富含gaba的食品有助于提高睡眠質(zhì)量、促進新陳代謝、恢復(fù)腦細胞活力等，臨床上主要用于高血壓、癲癇、心率失常、睡眠障礙、焦慮和抑郁癥等疾病的治療。在農(nóng)業(yè)畜牧方面，gaba作為食品添加劑可提高動物的免疫力和食欲，提高經(jīng)濟效益?；瘜W(xué)工業(yè)方面，gaba可合成2-吡咯烷酮和可生物降解材料聚酰胺尼龍4的前體。

2、目前，gaba的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成、植物富集及生物合成?；瘜W(xué)合成反應(yīng)速度快、產(chǎn)量高，但存在原料毒性大、反應(yīng)環(huán)境嚴格、設(shè)備成本高、易產(chǎn)生有毒有害副產(chǎn)物、造成環(huán)境污染等問題。相較于化學(xué)合成，通過低溫或高鹽脅迫處理從植物中富集gaba操作簡單、安全、壞境友好，但其存在富集產(chǎn)率低和成本高的局限性。生物合成是利用微生物將底物轉(zhuǎn)化為gaba，具有環(huán)境友好、反應(yīng)溫和、綠色環(huán)保的優(yōu)點，又因微生物具有繁殖周期短、生長快及適應(yīng)性強等特點受到廣泛關(guān)注。gaba的生物合成途徑主要是由吡哆醛5'-磷酸（pyridoxal-5'-phosphate；plp）依賴的谷氨酸脫羧酶（glμtamate?decarboxylase，gad）催化l-glu脫羧形成γ-氨基丁酸，反應(yīng)過程中消耗h+并產(chǎn)生co2。大多數(shù)gad只在低ph值下有活性，ph值高于6時幾乎完全喪失活性，通過在不同條件下對gad晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，gad的羧基端在酸性ph值下大多是開放的，但接近中性條件時，會形成類似于“塞”的結(jié)構(gòu)，阻止了底物谷氨酸在中性ph值下與活性位點的結(jié)合，因此，現(xiàn)有的gaba生物合成途徑存在以下問題：1）外源加入昂貴的plp，會導(dǎo)致gaba生產(chǎn)成本高；2）若外源加入plp不足，會導(dǎo)致酶活性低下；3）gad對ph值的適應(yīng)性較低；4）缺乏高效的轉(zhuǎn)運途徑。目前雖然已報道通過表達來自大腸桿菌的突變谷氨酸脫羧酶（glu89gln/δc452-462）或乳酸菌谷氨酸突變體（δc11/k17t/d294g/e312s/q346h）等方式提高gad在中性環(huán)境的活性，但這些方法仍存在輔酶因子不足以及缺乏高效轉(zhuǎn)運的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，用以解決現(xiàn)有的gaba生產(chǎn)成本高，酶活性低以及gad最適ph值與gaba一步法生產(chǎn)不兼容的技術(shù)問題。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個方面，公開了高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，以 e.colibl21（de3）作為宿主菌，在t7啟動子的作用下異源表達突變型谷氨酸脫羧酶的編碼基因 gadb△c11，再在arabad啟動子作用下異源表達串聯(lián)弱rbs的基因 gadc△c41和串聯(lián)強rbs的基因 pdxy，得到高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌；

4、其中，弱rbs的核苷酸序列如seq?id?no.14所示，強rbs的核苷酸序列如seq?idno.27所示。

5、優(yōu)選地，突變型谷氨酸脫羧酶的編碼基因 gadb△c11來源于植物乳植桿菌。

6、優(yōu)選地，基因 gadc△c41來源于 e.colidh5α。

7、優(yōu)選地，基因 pdxy來源于 e.colidh5α。

8、優(yōu)選地，異源表達突變型谷氨酸脫羧酶的編碼基因 gadb△c11用到的表達載體為pet28a。

9、優(yōu)選地，異源表達基因 gadc△c41和基因 pdxy用到的表達載體為pbad18。

10、本發(fā)明的第二個方面，公開了上述構(gòu)建方法得到的高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌。

11、本發(fā)明的第三個方面，公開了上述高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌在生產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的第四個方面，公開了一種全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，將上述高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌接種至含卡那霉素和氨芐霉素的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600＝0.6，同時加入iptg、l-阿拉伯糖和維生素b6誘導(dǎo)，收集菌體；在菌體中加入底物轉(zhuǎn)化，得到γ-氨基丁酸；

13、其中，每升含卡那霉素和氨芐霉素的lb液體培養(yǎng)基包括：10?g胰蛋白胨、5?g酵母浸粉、10?g?nacl、10?mm維生素b6、0.1?g卡那霉素和0.1?g氨芐霉素，余量為水。

14、優(yōu)選地，iptg的終濃度為0.5?mm。

15、優(yōu)選地，l-阿拉伯糖的終濃度為20~100?μm。

16、優(yōu)選地，維生素b6的終濃度為10?mm。

17、優(yōu)選地，在16℃，200?rpm誘導(dǎo)16?h。

18、優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化時，菌體濃度為5~20?od600。

19、優(yōu)選地，底物為l-谷氨酸或l-谷氨酸鈉。

20、優(yōu)選地，底物的濃度為600~1200?mg/ml。

21、優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化1~8?h。

22、優(yōu)選地，將上述構(gòu)建方法得到的高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌接種至含卡那霉素和氨芐霉素的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600＝0.6，加入終濃度為0.5?mm的iptg、終濃度為60?μm的l-阿拉伯糖和終濃度為10?mm的維生素b6誘導(dǎo)，收集菌體；在濃度為15?od600的菌體中加入濃度為1200?mg/ml的l-谷氨酸轉(zhuǎn)化7?h，得到γ-氨基丁酸。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、本發(fā)明提供的高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重組大腸桿菌，以大腸桿菌bl21（de3）（簡稱 e.colibl21（de3））作為宿主菌，利用 e.colibl21（de3）整合有噬菌體t7?rna聚合酶基因的特性，將 e.colibl21（de3）與含有強誘導(dǎo)型啟動子t7的表達載體pet28a聯(lián)用來異源表達調(diào)控植物乳酸桿菌來源的突變型谷氨酸脫羧酶的編碼基因（glutamate?decarboxylase?b， gadb△c11），將重組大腸桿菌對ph的響應(yīng)范圍擴大至中性。通過使用弱誘導(dǎo)型阿拉伯糖啟動子（arabad）、弱核糖體結(jié)合位點序列（ribosome?binding?site，rbs）和強rbs表達調(diào)控突變型γ-氨基丁酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運通道基因（glu/gaba?antiporter， gadc△c41）以及吡哆醛5'-磷酸激酶編碼基因（pyridoxal?kinase， pdxy），通過基因 gadc△c41來提高γ-氨基丁酸的產(chǎn)量，緩解胞內(nèi)代謝壓力；通過基因 pdxy來催化廉價的維生素b6以生成plp，在大腸桿菌中構(gòu)建內(nèi)源plp回補途徑，既滿足了谷氨酸脫羧酶對輔酶因子plp的需求，又顯著降低了生產(chǎn)成本；通過聯(lián)合弱rbs和強rbs進行調(diào)控，能夠防止過表達 gadc△c41毒害菌株，保證γ-氨基丁酸的產(chǎn)量維持在最適水平。該方法不僅能夠滿足gad的輔酶需求，而且大幅提升了產(chǎn)物gaba的合成效率，能夠解除微生物在轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)γ-氨基丁酸的過程中對外源昂貴輔因子plp的依賴。

25、本發(fā)明提供的一種全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，利用構(gòu)建的重組大腸桿菌，采用全細胞催化，通過加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl?β-d-thiogalactoside；iptg）誘導(dǎo)谷氨酸脫羧酶基因表達，通過加入l-阿拉伯糖誘導(dǎo) pdxy和 gadc△c41基因表達，通過加入維生素b6為gad提供輔酶因子plp，發(fā)酵過程中無需調(diào)節(jié)ph值，就可在7?h通過轉(zhuǎn)化1200?mg/ml的l-谷氨酸，獲得747.8?mg/ml的gaba，摩爾轉(zhuǎn)化率達88.93%，實現(xiàn)一步法高效生物合成gaba。