本發(fā)明涉及界面化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、過(guò)量的活性氧(ros)會(huì)對(duì)細(xì)胞必需成分造成氧化損傷，并導(dǎo)致各種人類(lèi)疾病，如癌癥以及心血管、眼部和神經(jīng)退行性疾病。ros相關(guān)疾病通常用天然或人工化學(xué)抗氧化劑治療。然而，各種抗氧化劑未能顯示出對(duì)抗氧化應(yīng)激的明顯臨床益處，尤其是對(duì)氧化損傷引起的慢性疾病?；瘜W(xué)抗氧化劑失敗的可能原因包括：1)無(wú)法進(jìn)入組織/器官或氧化損傷部位，2)干擾正常水平的ros關(guān)鍵生理功能，以及3)毒性副作用。這些方面強(qiáng)調(diào)了對(duì)創(chuàng)新抗氧化方法的迫切需求。

2、超小納米氣泡(unb)具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，可以解決這些問(wèn)題并為抗氧化提供一種新方法。unb是懸浮在水中的納米級(jí)(小于50納米)氣泡。我們最近的研究證明，氧和氮unb可以保護(hù)水溶液中的有機(jī)分子或金屬表面免受化學(xué)產(chǎn)生的ros的氧化損傷。unb的ros清除機(jī)制不同于化學(xué)抗氧化劑，如最近的一篇評(píng)論中所分類(lèi)。這種方法已顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)抗氧化劑的明顯優(yōu)勢(shì)，包括可持續(xù)性、穩(wěn)定性和生物安全性。因此，如果unb能夠在細(xì)胞水平上發(fā)揮抗氧化作用，那么這些優(yōu)勢(shì)將被用于緩解生物體的氧化應(yīng)激。正如barryhalliwell所指出的，許多抗氧化劑的體外和體內(nèi)效果并不總是一致的。例如，硫化氫和褪黑激素在體外表現(xiàn)出ros清除能力，但在體內(nèi)卻不能達(dá)到同等的抗氧化效果。同時(shí)，雖然抗壞血酸等化合物可以在體內(nèi)清除ros，但它們不一定能減少氧化損傷，因?yàn)楸仨毧紤]非局部作用和潛在的有毒副產(chǎn)物等因素。因此，體外抗氧化作用通常不會(huì)轉(zhuǎn)化為體內(nèi)作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)因其分化成多種細(xì)胞類(lèi)型的能力及其在再生醫(yī)學(xué)中的潛力，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。其應(yīng)用范圍涵蓋組織工程以及炎癥和自身免疫性疾病的治療。鑒于其治療潛力，對(duì)msc的需求不斷增加。為了滿足這一需求，體外大規(guī)模擴(kuò)增msc至關(guān)重要。然而，在保持細(xì)胞質(zhì)量和功能的同時(shí)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增面臨諸多挑戰(zhàn)。增加體外msc擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法包括使用生物反應(yīng)器、優(yōu)化培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子。盡管這些方法取得了一定成功，但也存在局限性。生物反應(yīng)器可能昂貴且復(fù)雜，優(yōu)化培養(yǎng)基可能并不總是支持長(zhǎng)期細(xì)胞活力，而生長(zhǎng)因子可能帶來(lái)變異性和潛在的安全問(wèn)題。解決這些缺點(diǎn)對(duì)于推進(jìn)基于msc的療法至關(guān)重要。需要持續(xù)研究和創(chuàng)新，以開(kāi)發(fā)更高效、更具成本效益和更可靠的大規(guī)模msc擴(kuò)增方法?？朔@些挑戰(zhàn)將釋放msc在醫(yī)療應(yīng)用中的全部潛力，最終改善患者的治療效果并推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

3、大規(guī)模msc擴(kuò)增的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是復(fù)制性衰老，即細(xì)胞在連續(xù)幾代中增殖和維持干性的能力逐漸下降。在導(dǎo)致復(fù)制性衰老的因素中，活性氧(ros)的積累是重要的因素之一。ros可引起氧化應(yīng)激并損害細(xì)胞成分，進(jìn)而影響細(xì)胞功能和加速衰老。為了減輕ros的影響并延長(zhǎng)msc的復(fù)制壽命，研究人員使用外源性抗氧化劑來(lái)中和ros，從而減少氧化應(yīng)激并可能增加msc在體外可以經(jīng)歷的細(xì)胞分裂次數(shù)。多項(xiàng)研究報(bào)告稱(chēng)，使用抗氧化劑可以成功增強(qiáng)msc的增殖和壽命。然而，化學(xué)抗氧化劑有時(shí)會(huì)干擾正常的細(xì)胞信號(hào)通路，并且抗氧化劑對(duì)msc及其治療潛力的長(zhǎng)期影響仍不明確。解決這些缺陷對(duì)于優(yōu)化體外msc擴(kuò)增至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)抗氧化劑的效用低且存在多種風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題。

2、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中含有粒徑小于50nm的超小粒徑納米氣泡，該超小粒徑納米氣泡在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的總濃度>1011個(gè)/毫升。

3、優(yōu)選地，所述超小粒徑納米氣泡在動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dls)測(cè)量中表現(xiàn)為粒徑分布范圍在1nm～50nm，更優(yōu)選為2nm～15nm。

4、根據(jù)本發(fā)明提供的超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基，所述超小粒徑納米氣泡在納米粒子追蹤分析系統(tǒng)(nta)測(cè)量中表現(xiàn)為粒徑的大小在50nm以下，其中在動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dls)測(cè)量中10nm附近的氣泡數(shù)占據(jù)了總數(shù)的絕大部分。優(yōu)選地，動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dls)測(cè)量中粒徑分布范圍在1nm～15nm的氣泡數(shù)占據(jù)總數(shù)的99％以上。

5、優(yōu)選地，超小粒徑納米氣泡濃度高于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dls)檢測(cè)限，所述納米氣泡的dls數(shù)量強(qiáng)度占比>99％。

6、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：s1：將需要引入超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基冷卻到-20℃～-80℃；s2：將冷卻后的細(xì)胞培養(yǎng)基放入到加壓裝置內(nèi)；s3：向所述加壓裝置中通入高壓氣體或采用機(jī)械力加壓，以增大加壓裝置內(nèi)部壓力；s4：維持高壓條件，持續(xù)一段時(shí)間；s5：緩慢釋壓至常壓狀態(tài)，即可制備得到一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)。

7、優(yōu)選地，步驟s1包括：將需要引入超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基冷卻至-20℃～-80℃。最優(yōu)選地，冷卻至-80℃。應(yīng)當(dāng)理解的是，將細(xì)胞培養(yǎng)基冷卻至-20℃～-80℃可以更好地引入超小粒徑納米氣泡。

8、步驟s1中的所述細(xì)胞培養(yǎng)基可以根據(jù)需要任意選擇，包含但不限于完全培養(yǎng)基、維持培養(yǎng)基、干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基、商用品牌細(xì)胞培養(yǎng)基等等。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明方法適用于任何細(xì)胞培養(yǎng)基，并不僅限于干細(xì)胞培養(yǎng)基，也不對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基的配方有任何限定要求。

9、優(yōu)選地，步驟s3包括：向所述加壓裝置中通入高壓氣體，根據(jù)不同需要選擇不同的氣體種類(lèi)，包括氮?dú)?、氧氣、氫氣、空氣等等?/p>

10、優(yōu)選地，步驟s3、s4包括：所述高壓條件的壓力范圍為0.2mpa～1.2mpa，維持時(shí)間20min～60min。

11、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟s4中的壓力范圍為0.4mpa～1.2mpa，維持時(shí)間40min～60min。

12、優(yōu)選地，步驟s5包括：釋壓過(guò)程采用氣體流量計(jì)控制釋氣速率。

13、優(yōu)選地，除了步驟s1之外，步驟s2～s5中不進(jìn)行任何額外的升溫或降溫操作，保持細(xì)胞培養(yǎng)基溫度正常變化。

14、但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明通過(guò)低溫加壓減壓法來(lái)制備含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，首次發(fā)現(xiàn)低于50nm的納米氣泡具備抗衰老功效。其中，制備超小粒徑納米氣泡的方法是可替代的。換句話說(shuō)，通過(guò)其他方法制備出的含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，應(yīng)該也具備相同的抗衰老功效。

15、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基在延緩間充質(zhì)干細(xì)胞體外復(fù)制性衰老的應(yīng)用。

16、根據(jù)本發(fā)明的第四方面，還提供一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基在緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激中的應(yīng)用。

17、根據(jù)本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，超小粒徑納米氣泡具備延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的功效，因此含有該超小粒納米氣泡的超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基也具有延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的功效。根據(jù)本發(fā)明的研究還發(fā)現(xiàn)，超小粒徑納米氣泡具備緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激的功效，因此含有該超小粒納米氣泡的超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基也具有緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激的功效。

18、鑒于化學(xué)抗氧化劑的局限性，超小粒徑納米氣泡已成為降低細(xì)胞內(nèi)ros水平的有希望的替代方案。這些納米氣泡具有獨(dú)特的特性，可直接降低細(xì)胞內(nèi)的ros，從而保護(hù)細(xì)胞內(nèi)生物大分子的穩(wěn)定性并保持細(xì)胞活力。鑒于這些優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明制備了一種原位引入超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，并將其用于小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和培養(yǎng)。結(jié)果表明超小粒徑納米氣泡的存在顯著延緩了msc的衰老并在保持其干細(xì)胞特性的同時(shí)增加了細(xì)胞分裂次數(shù)。這表明本發(fā)明制備的含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基可以減緩msc的體外擴(kuò)增導(dǎo)致的衰老。本發(fā)明為優(yōu)化干細(xì)胞培養(yǎng)條件提供了新的見(jiàn)解和方法，最終有助于再生醫(yī)學(xué)和治療應(yīng)用的發(fā)展。

19、根據(jù)本發(fā)明提供的這樣一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，與中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“一種小粒徑納米氣泡水及其制備方法以及應(yīng)用”相比，不同之處主要包括以下幾點(diǎn)：

20、首先，超小粒徑納米氣泡存在的介質(zhì)不同，本發(fā)明首次制備出了這樣一種原位引入超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基，截止到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)從未公開(kāi)過(guò)本發(fā)明這樣一種采用細(xì)胞培養(yǎng)基低溫加壓減壓制備含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法；

21、其次，本發(fā)明還首次發(fā)現(xiàn)這樣一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基具有延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老以及緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激的效果；

22、再次，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中超小粒徑納米氣泡的總濃度更高，本發(fā)明要求超小粒徑納米氣泡在細(xì)胞培養(yǎng)基中的總濃度>1011個(gè)/毫升，而在先專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)的小粒徑納米氣泡水僅要求濃度>107個(gè)/毫升。其原因在于，根據(jù)本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，如果濃度低于1011個(gè)/毫升(比如，107個(gè)/毫升～1011個(gè)/毫升之間)，可能無(wú)法產(chǎn)生延緩間充質(zhì)干細(xì)胞體外復(fù)制性衰老的技術(shù)效果，參見(jiàn)本發(fā)明各實(shí)施例中的nnbs組。

23、根據(jù)本發(fā)明提供的一種含有超小粒徑納米氣泡的細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法以及應(yīng)用，其相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)越性在于：

24、1)不添加外源抗氧化劑的情況下，即可制備出一種具有抗衰老和抗氧化功效的超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基，其中的絕大多數(shù)納米氣泡大小在10納米附近；

25、2)通過(guò)低溫冷凍后細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行先加壓、后減壓，提供了一種向細(xì)胞培養(yǎng)基中原位引入超小粒徑納米氣泡的方法；

26、3)通過(guò)本發(fā)明制備的超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基的抗衰老功效不依賴(lài)于額外添加還原劑，因此能夠避免上述化學(xué)還原劑的缺陷；

27、4)本發(fā)明提供的這樣一種超小粒徑納米氣泡細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法不僅可用于延緩間充質(zhì)干細(xì)胞體外復(fù)制性衰老，還有望應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、醫(yī)療美容、健康增壽等領(lǐng)域。