本發(fā)明屬于核酸檢測，具體涉及一種靈敏檢測完整mirna的方法，該方法基于特異性rna環(huán)化并結(jié)合滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄及恒溫指數(shù)擴增，用于靈敏檢測完整mirna。

背景技術(shù)：

1、microrna(mirna)是一類由19-24個核苷酸組成的短鏈非編碼rna，可在轉(zhuǎn)錄后對蛋白質(zhì)表達進行調(diào)控，可參與多種代謝過程，并可實現(xiàn)跨界調(diào)控。mirna還可參與調(diào)控多種人類疾病，因此，也被認為是臨床診斷和治療的有前途的生物標志物。但由于自然界中可水解rna的酶無處不在，而mirna一旦被水解，便會影響其發(fā)揮功能。因此，mirna保持完整(mirna的末端無核苷酸缺失)對其發(fā)揮功能至關(guān)重要。

2、rt-qpcr的方法作為mirna檢測的“金標準”，仍存在無法判斷靶標是否完整的問題。若靶標mirna的末端存在1-2nt的堿基缺失，仍可與探針鏈的突出粘性末端互補，并在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將引物延伸，并經(jīng)pcr過程產(chǎn)生信號，引發(fā)假陽性問題。

3、隨著等溫擴增技術(shù)發(fā)展，如滾環(huán)擴增(rca)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(lamp)等技術(shù)逐漸融入到mirna檢測技術(shù)中，這些方法一方面提高了mirna檢測的靈敏度，另一方面還具有特異性強和操作簡便等優(yōu)勢。目前基于等溫擴增原理來檢測mirna的方法主要包括三種類型：一類是加入一條與靶標mirna互補的環(huán)狀dna探針，以探針鏈為模板，靶標mirna作為引物引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)。但是，若靶標mirna的3′或5′端存在1-2nt缺失，仍可與探針鏈互補并作為引物引發(fā)擴增反應(yīng)，產(chǎn)生信號。第二類是以一條單鏈dna為探針鏈，靶標mirna作為輔助鏈，與探針鏈的兩末端均存在互補，二者經(jīng)雜交后形成nick結(jié)構(gòu)，在連接酶的作用下封閉nick，形成環(huán)狀dna。并以環(huán)狀dna為模板，以靶標mirna為引物進行滾環(huán)擴增。這一類方法存在同樣的問題，即，對于末端存在1-2nt缺失的靶標mirna，仍可與探針鏈雜交形成環(huán)狀dna，并以此為模板進行擴增反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號。第三類是加入兩條dna探針鏈，靶標mirna作為輔助鏈，與兩條探針鏈雜交形成nick結(jié)構(gòu)，在連接酶作用下封閉nick，兩條探針鏈連接形成的單鏈dna可作為lamp擴增的模板，加入引物后進行l(wèi)amp擴增反應(yīng)。同樣的，若靶標mirna的3′或5′端缺失1-2nt核苷酸，仍可與探針鏈雜交形成nick結(jié)構(gòu)，經(jīng)連接酶封閉后進行后續(xù)的擴增反應(yīng)，并產(chǎn)生信號，引發(fā)假陽性問題。

4、綜上，目前現(xiàn)有的檢測方法均存在著無法辨別靶標mirna是否完整的問題。因此，亟需建立一種可靈敏檢測完整mirna的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方法無法辨別靶標mirna是否完整的問題，提出了一種靈敏檢測完整mirna的方法，該檢測方法利用連接酶連接缺口(gap)結(jié)構(gòu)的效率顯著低于連接切口(nick)結(jié)構(gòu)這一特性，實現(xiàn)了完整mirna的高靈敏檢測和定量檢測，具有特異性強、檢測限低和線性范圍廣等優(yōu)點。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供了一種靈敏檢測完整mirna的方法，該方法的檢測原理如圖1所示。通過加入一條rna探針鏈(probe)和兩條dna輔助鏈(splint-a和splint-b)，兩條splint與probe和完整的靶標mirna雜交后形成兩個nick結(jié)構(gòu)；在連接酶作用下封閉nick形成封閉的環(huán)狀rna；最后經(jīng)滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄及恒溫指數(shù)擴增步驟產(chǎn)生信號。而末端缺少部分核苷酸的非完整mirna雜交后會形成gap結(jié)構(gòu)，難以連接或不能連接，經(jīng)擴增步驟后，最終難以產(chǎn)生信號或者不能產(chǎn)生信號。

4、本發(fā)明提供的一種靈敏檢測完整mirna的方法，包括以下步驟：

5、(1)設(shè)計一條探針鏈(probe)，探針鏈為25-60nt長的rna，根據(jù)靶標mirna和探針鏈的序列信息，設(shè)計兩條dna輔助鏈(splint-a和splint-b)，dna輔助鏈長度為14-20nt，其與探針鏈和靶標mirna鏈各互補7-13nt；

6、設(shè)計一對引物f/f′，引物f/f′長度為18-23nt的dna，其中，引物f包含18-23nt與靶標mirna互補的序列，引物f′包含18-23nt與靶標mirna相同的序列；防止在擴增過程中由probe自環(huán)化引起的非特異性擴增；

7、(2)將兩條dna輔助鏈(splint-a、splint-b)、probe以及mirna與連接酶緩沖溶液混合，于80-90℃反應(yīng)3-5min，再以0.1℃/s的速度降溫至20-25℃保持5-20min進行退火，而后加入連接酶；splint-a、splint-b、probe與完整的靶標mirna經(jīng)退火后雜交形成兩個nick結(jié)構(gòu)，在連接酶的作用下封閉nick形成環(huán)狀rna；對于末端被部分水解的不完整mirna，難以或無法連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(同splint-a、splint-b和probe雜交后形成缺失(gap)結(jié)構(gòu))。

8、(3)向步驟(2)的反應(yīng)體系中加入核糖核酸外切酶rnase?r進行酶切反應(yīng)，于25-37℃反應(yīng)10-30min，除去線性rna，得到環(huán)狀rna；

9、(4)向步驟(3)的反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，以環(huán)狀rna為模板，以步驟(2)中加入的一條或兩條dna輔助鏈為引物進行擴增，42-50℃保持30-120min，進行滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(rt-rca)，反應(yīng)生成的產(chǎn)物為長的重復(fù)單鏈dna；

10、(5)向步驟(4)反應(yīng)體系中加入bst?2.0dna聚合酶、引物f/f′和熒光染料，置于qpcr儀中55-65℃反應(yīng)60-120min；以步驟(4)生成的長的重復(fù)單鏈dna為模板，以f/f′為引物，進行恒溫指數(shù)擴增反應(yīng)并檢測熒光信號。

11、進一步的，所述步驟(1)中，探針鏈的gc含量大于20％；優(yōu)選地，所述探針鏈中g(shù)c含量為30-70％。

12、進一步的，dna?splint長度為14-20nt。當探針鏈與靶標mirna的gc含量為50-70％時，對應(yīng)的dna輔助鏈長度為14-18nt；探針鏈與靶標mirna的gc含量為30-50％時，對應(yīng)的dna輔助鏈長度為18-20nt。

13、進一步的，所述步驟(1)設(shè)計的引物f與f′之間存在三種互補情況，其中，可以為完全互補；也可以為3′端存在1-5nt突出，5′端連續(xù)13-22nt互補；也可以為5′端存在1-5nt突出，3′端連續(xù)13-22nt互補。引物f與f′之間的互補可避免由引物與體系中非模板核酸錯搭產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

14、進一步的，所述步驟(2)中，探針鏈的濃度為20-200nm，兩條splint鏈濃度為40-1000nm。

15、進一步的，所述步驟(2)中，連接酶為dna連接酶或t4?rna連接酶2，連接酶的濃度為0.01-1.0u/μl，連接條件為：25-50℃反應(yīng)5-120min；

16、連接酶緩沖溶液的終濃度為標準濃度的0.05-2倍。

17、進一步的，所述步驟(2)的連接反應(yīng)中，對于末端被部分水解的不完整mirna，與探針鏈和兩條dna輔助鏈雜交后形成缺口結(jié)構(gòu)，在連接酶的作用下難以或無法連接成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

18、進一步的，所述步驟(3)中，rnase?r濃度為0.1-1.0u/μl。

19、所述步驟(3)的酶切反應(yīng)體系中還加入了rnase?r緩沖溶液，rnase?r緩沖溶液的終濃度為標準濃度的0.05-2倍。

20、進一步的，所述步驟(4)中的逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為1.0-10u/μl。

21、進一步的，所述步驟(5)中，引物f和f′濃度為0.1-5.0μm；bst?2.0dna聚合酶的濃度為0.1-1.0u/μl。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、(1)本發(fā)明提供的檢測方法，利用特異性rna環(huán)化并結(jié)合rt-rca及恒溫指數(shù)擴增的方式區(qū)分完整與非完整靶標mirna，依據(jù)連接酶連接缺口結(jié)構(gòu)的效率顯著低于切口結(jié)構(gòu)的特性實現(xiàn)精準檢測完整的靶標mirna；

24、該方法用于精準檢測完整靶標mirna，對于完整靶標mirna的檢測限可達到100fm，且即使靶標mirna只存在1nt缺失也不會造成假陽性結(jié)果。

25、(2)本發(fā)明設(shè)計的通用型rna探針鏈，無需針對不同靶標序列進行特異性設(shè)計，大大降低了檢測成本。

26、(3)本發(fā)明在環(huán)化過程中所添加的兩條dna?splint鏈，在環(huán)化后無需去除，且可作為引物引發(fā)rt-rca反應(yīng)。

27、(4)本發(fā)明在恒溫下即可實現(xiàn)指數(shù)擴增，無需傳統(tǒng)pcr的熱循環(huán)過程。