本發(fā)明涉及植物基因工程和農(nóng)業(yè)生物，具體涉及一種鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因及其應(yīng)用

背景技術(shù)：

1、白絹病，又稱白絲病或菌核病，是嚴(yán)重威脅鐵皮石斛等植物健康的主要病害之一。關(guān)于該病的病原菌鑒定，已有研究指出，導(dǎo)致鐵皮石斛白絹病的主要病原菌為擔(dān)子菌門下的半知菌亞門，具體為齊整小核菌(sclerotium?rolfsii?sacc.)和翠雀小核菌(sclerotium?delphiniiwelch)。病原菌屬于具有廣泛寄主范圍的腐生性真菌，偏好高溫、濕潤的環(huán)境，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的草原和雨林中。在這些高溫濕潤的氣候條件下，病原菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的侵染能力，能夠?qū)Χ喾N植物，包括農(nóng)作物和花卉，造成嚴(yán)重的危害。對(duì)于鐵皮石斛等中藥材的種植業(yè)來說，白絹病的爆發(fā)常常伴隨著巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、白絹病在鐵皮石斛上的發(fā)病初期表現(xiàn)為在莖基部或栽培基質(zhì)上出現(xiàn)明顯的白色菌絲，這些菌絲逐漸向莖稈和葉片擴(kuò)展，導(dǎo)致葉片逐步壞死。在病害的進(jìn)一步發(fā)展中，莖稈開始出現(xiàn)腐爛，逐漸彎曲并最終枯死。隨著病情加重，死亡的葉片和莖稈上還會(huì)形成堅(jiān)硬的菌核，而莖基部和根部也會(huì)表現(xiàn)出明顯的腐爛癥狀。這一過程不僅嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)，還會(huì)在植株的關(guān)鍵部位造成毀滅性的傷害。在鐵皮石斛的種植過程中，特別是在組培苗的煉苗馴化階段，白絹病極易爆發(fā)，導(dǎo)致大面積幼苗死亡，給種植者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)損失。由于白絹病的快速傳播和強(qiáng)大的致病能力，常常在短時(shí)間內(nèi)對(duì)整個(gè)種植環(huán)境造成嚴(yán)重影響，進(jìn)一步加大了病害的防治難度。這種病害不僅對(duì)鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成威脅，還增加了種植成本，成為鐵皮石斛種植中亟需解決的難題之一。

3、目前，白絹病的防治方法主要依賴于化學(xué)殺菌劑。然而，長(zhǎng)期、大量使用化學(xué)殺菌劑不僅可能引發(fā)環(huán)境污染問題，還會(huì)促使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降。因此，尋找更為環(huán)保、可持續(xù)的防治措施已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)方向之一。在此背景下，植物自身抗病基因的研究顯得尤為重要。通過對(duì)抗白絹病基因的篩選和克隆，有望為植物抗病育種提供新的基因資源，從而開發(fā)出更加綠色、安全的防控手段，減少化學(xué)藥劑的依賴，為農(nóng)作物和中藥材的健康種植提供更有力的保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因，本發(fā)明鑒定了一個(gè)新的鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因dof013141，其過表達(dá)材料可以顯著提高鐵皮石斛對(duì)白絹病的抗性。本發(fā)明的dof013141基因通過調(diào)控植物內(nèi)部防御機(jī)制，顯著提高鐵皮石斛對(duì)白絹病的抗性，為抗病植物的培育提供了重要的基因資源，為白絹病抗性鐵皮石斛植株品種選育提供技術(shù)支撐。

2、本發(fā)明還提供所述鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因的應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所述一種鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因dof013141，所述基因dof013141的cds序列如seq?id?no.1所示。

4、其中，所述基因還包括與seq?id?no.1編碼具有相似結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，在結(jié)構(gòu)和功能上與dof013141基因具有高度相似性。

5、其中，用于擴(kuò)增所述基因dof013141的cds全長(zhǎng)序列引物為：

6、dof013141-f：atggaagtacatggaggagca

7、dof013141-r：ctattgttgtaaatagcaaaaatcttcc。

8、本發(fā)明所述的鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因dof013141過表達(dá)載體pcambia1301-35sn-dof013141。

9、其中，所述過表達(dá)載體構(gòu)建方法為：

10、設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增所述基因dof013141的cds基因引物，以基因dof013141的cds基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物連接到植物表達(dá)載體pcambia1301-35sn后，通過轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，最終得到過表達(dá)載體pcambia1301-35sn-dof013141。

11、其中，所述植物表達(dá)載體pcambia1301-35sn的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

12、本發(fā)明所述宿主細(xì)胞，以農(nóng)桿菌為出發(fā)菌株，其含有所述的過表達(dá)載體pcambia1301-35sn-dof013141。

13、本發(fā)明所述的基因dof013141或者所述的過表達(dá)載體或者所述的宿主細(xì)胞在提高鐵皮石斛對(duì)白絹病抗性中的應(yīng)用。

14、其中，通過過表達(dá)dof013141基因，提升鐵皮石斛白絹病抗性。

15、本發(fā)明所述的基因dof013141或者所述的過表達(dá)載體或者所述的宿主細(xì)胞在培育白絹病抗性鐵皮石斛植株中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明dof013141基因在鐵皮石斛中的過表達(dá)及其抗白絹病效果驗(yàn)證，本發(fā)明驗(yàn)證dof013141基因在鐵皮石斛中過表達(dá)后對(duì)白絹病抗性的提升效果，并詳細(xì)描述基因工程手段的具體操作步驟。

17、1、dof013141基因的獲取與載體構(gòu)建

18、首先，從鐵皮石斛中提取總rna，通過逆轉(zhuǎn)錄pcr擴(kuò)增獲得dof013141基因的全長(zhǎng)cdna序列。

19、將dof013141基因克隆至植物表達(dá)載體pcambia130中，并通過35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其高效表達(dá)。在構(gòu)建完成后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組載體以備轉(zhuǎn)化使用。

20、2、dof013141基因的植物轉(zhuǎn)化與過表達(dá)

21、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將dof013141基因?qū)腓F皮石斛葉片中。具體步驟如下：用1ml的針頭在鐵皮石斛葉片背面輕輕點(diǎn)開一個(gè)小口(注意不要刺穿)，再用去掉針頭的針管吸取菌液，從葉片傷口處注射到葉片中(以手指抵住葉片正面，將菌液從葉片的背面滲透進(jìn)去)。用記號(hào)筆標(biāo)記鐵皮石斛葉片水漬狀區(qū)域。注射過的植株于黑暗下放置12h，然后于26℃左右培養(yǎng)，導(dǎo)入后第3天采集葉片樣本。使用pcr和qrt-pcr方法驗(yàn)證dof013141基因在鐵皮石斛葉片中的表達(dá)水平，確認(rèn)該基因的高水平表達(dá)。

22、3、白絹病抗性測(cè)試

23、為了測(cè)試dof013141基因?qū)Π捉伈〉目剐孕Ч?，將?duì)照組(未轉(zhuǎn)基因鐵皮石斛植株)和實(shí)驗(yàn)組(dof013141轉(zhuǎn)基因植株)置于相同條件下進(jìn)行人工接種試驗(yàn)。

24、具體步驟如下：

25、將攜帶dof013141基因的過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入來自鐵皮石斛葉片中，24h后，接種直徑為5mm的齊整小核菌菌絲塊于鐵皮石斛葉片。接種后，將植株放置在恒溫培養(yǎng)箱中保持適宜的濕度和溫度，以便觀察病害的發(fā)生和發(fā)展情況。接種后第3天記錄植株的病癥表現(xiàn)，包括病斑數(shù)量、面積以及病害進(jìn)展的速度。

26、4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

27、在接種后第3天，對(duì)照組的鐵皮石斛植株表現(xiàn)出明顯的白絹病癥狀，包括葉片接種菌塊處的病斑、葉片萎蔫和壞死，而dof013141轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性，病斑數(shù)量和面積顯著減少，植株生長(zhǎng)狀態(tài)較好。

28、5、總結(jié)

29、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，dof013141基因在鐵皮石斛中過表達(dá)后，顯著提高了植株對(duì)白絹病的抗性。本實(shí)施例證明了dof013141基因作為抗病基因在鐵皮石斛中的有效性，展示了其在抗病育種中的應(yīng)用潛力。

30、本發(fā)明分離鑒定到來自鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因dof013141，該基因的cds核苷酸序列如seq?id?no.1所示。dof013141基因通過調(diào)控植物內(nèi)部防御機(jī)制，顯著提高鐵皮石斛對(duì)白絹病的抗性，為抗病植物的培育提供了重要的基因資源。本發(fā)明中dof013141全長(zhǎng)cds序列可人工合成，先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)。本發(fā)明首先通過化學(xué)手段合成其完整的編碼基因，然后通過適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)在生物體中實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)。這一過程為大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用該基因提供了可行的技術(shù)路徑，有助于合成并表達(dá)抗病蛋白。本發(fā)明中在其他植物中編碼上述相似結(jié)構(gòu)域蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，涵蓋了在其他植物中編碼具有相似結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，這些基因雖然來源于不同的植物，但在結(jié)構(gòu)和功能上與dof013141基因具有高度相似性，能夠在相關(guān)植物中發(fā)揮抗病作用，因此也屬于本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。本發(fā)明還提供含有所述基因dof013141的重組載體或重組微生物，保護(hù)包含dof013141基因的重組載體或重組微生物。這些重組體能夠在適合的宿主中表達(dá)該基因，進(jìn)而產(chǎn)生抗白絹病的相關(guān)蛋白質(zhì)，適用于植物的遺傳改良、育種及其他科研應(yīng)用。含有所述基因的重組載體和微生物不僅能用于提高植物抗病能力，還能在植物生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

31、本發(fā)明基因dof013141的應(yīng)用如下：調(diào)控鐵皮石斛的白絹病抗性；增強(qiáng)或降低鐵皮石斛的白絹病抗性。具體的，通過過表達(dá)該基因，將導(dǎo)致鐵皮石斛對(duì)白絹病抗性的增強(qiáng)。因此可將本發(fā)明所述基因與植物中過表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)合后導(dǎo)入合適的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植物宿主，進(jìn)而改變白絹病抗性，調(diào)控植物產(chǎn)量。

32、本發(fā)明提供了一種新型的鐵皮石斛抗白絹病基因dof013141及其廣泛應(yīng)用。該基因通過基因工程手段在鐵皮石斛中進(jìn)行過表達(dá)后，顯著增強(qiáng)了植物對(duì)白絹病的抗性，極大地提升了鐵皮石斛的抗病能力和存活率，從而減少了因病害引起的產(chǎn)量損失。本發(fā)明通過分離并篩選出dof013141基因，成功克服了傳統(tǒng)化學(xué)防治方法帶來的環(huán)境污染和抗藥性問題，基因的過表達(dá)不僅有效降低了對(duì)化學(xué)藥劑的依賴，也為綠色、可持續(xù)的農(nóng)業(yè)防控提供了新的技術(shù)解決方案。dof013141基因的應(yīng)用前景廣泛，除了在鐵皮石斛中的成功表現(xiàn)外，還可以推廣到其他易感植物的抗病育種項(xiàng)目中，進(jìn)一步拓寬其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明不僅為提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了有力保障，同時(shí)也為植物抗病基因的開發(fā)和利用開辟了新的研究方向，具有極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

33、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

34、本發(fā)明鑒定了一個(gè)新的鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的基因dof013141，為鐵皮石斛白絹病抗性分子遺傳改良提供新的基因資源。進(jìn)一步本發(fā)明獲得了白絹病抗性能力增強(qiáng)的鐵皮石斛新種質(zhì)。本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得鐵皮石斛基因dof013141過表達(dá)突變體，與對(duì)照相比，過表達(dá)突變體鐵皮石斛的抗白絹病能力顯著增強(qiáng)。

35、本發(fā)明利用分子生物學(xué)方法克隆一個(gè)基因dof013141，并證明了其調(diào)控鐵皮石斛白絹病抗性相關(guān)的功能。本發(fā)明dof013141基因的應(yīng)用前景廣泛，除了在鐵皮石斛中的成功表現(xiàn)外，還可以推廣到其他易感植物的抗病育種項(xiàng)目中，進(jìn)一步拓寬其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。該發(fā)明不僅為提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了有力保障，同時(shí)也為植物抗病基因的開發(fā)和利用開辟了新的研究方向，具有極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。