本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測分析，具體涉及一種特異性結(jié)合心肌肌鈣蛋白i的核酸適配體及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、急性心肌梗死（ami）已被世界衛(wèi)生組織列為全球主要死亡原因之一，預(yù)計到2030年將導(dǎo)致2300萬人死亡。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、低成本的ami診斷方法引起了研究人員的極大興趣。目前，一些心臟生物標(biāo)志物，如心肌肌鈣蛋白i（ctni）、肌紅蛋白（mb）、肌酸激酶mb（ck-mb）和c反應(yīng)蛋白（c-rp），已被用于診斷ami。與其他生物標(biāo)志物相比，ctni在ami診斷中具有較高的特異性和敏感性。原因是ctni在ami發(fā)生后釋放到人體中，并在2-3小時后以非常低的濃度（臨界值0.01-0.1?ng/ml）釋放到血液循環(huán)中，在24小時內(nèi)達(dá)到峰值。因此，準(zhǔn)確、超靈敏地檢測ctni為早期ami的診斷提供了一種有價值的方法。

2、已經(jīng)報道了用于檢測ctni的各種傳感方法，如表面等離子體共振（spr）、光學(xué)傳感、酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）和電化學(xué)，其中檢測元件包括抗體、適配體、dna和rna。在這些方法中，elisa具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，已廣泛應(yīng)用于臨床ctni測定。然而，這種方法使用抗體作為識別元件，抗體容易受到溫度、鹽濃度和ph值的影響，生產(chǎn)成本高，難以修飾。此外，這種方法操作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)的操作員，不方便，耗時。近年來，核酸適配體由于其高穩(wěn)定性、長保質(zhì)期、低成本和易于修飾，已成為治療和診斷應(yīng)用中抗體的替代品。

3、現(xiàn)有技術(shù)報導(dǎo)中篩選出心肌肌鈣蛋白i（ctni）的核酸適配體apt-40原始鏈有40個堿基，它的二級結(jié)構(gòu)自由能為-5.93?kcal/mol，架構(gòu)相對比較穩(wěn)定，需要重新設(shè)計序列以實現(xiàn)較大的構(gòu)象變化。因此，對核酸適配體apt-40序列重新裁短設(shè)計，破壞核酸適配體的雙鏈莖的架構(gòu)，降低其穩(wěn)定性，在沒有靶標(biāo)存在的情況下，有利于核酸適配體展開狀態(tài)的形成，同時保留了對靶標(biāo)的識別和結(jié)合的能力，也增加核酸適配體與ctni結(jié)合時的構(gòu)象變化，適用于e-ab傳感器的制作。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種特異性結(jié)合心肌肌鈣蛋白i的核酸適配體及其篩選方法與應(yīng)用。該核酸適配體特異性強，穩(wěn)定性好，制備的電化學(xué)適配體傳感器分析過程簡單快捷，可用于心肌肌鈣蛋白i（ctni）的現(xiàn)場快速檢測。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種特異性結(jié)合心肌肌鈣蛋白i的核酸適配體的核酸適配體，所述核酸適配體包括如apt-38、apt-36、apt-34中任意一種所示的特征序列；

4、其中，所述apt-38的特征序列為：5′-gtgcagtacgccaacctt?tctcatgcgctgcccctctt-3′；?所述apt-36的特征序列為：5′-tgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctct-3′；所述apt-34的特征序列為：5′-gcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctc-3′。

5、進一步的，上述的核酸適配體與心肌肌鈣蛋白i的結(jié)合能大小滿足：apt-34>apt-38>apt-36。

6、進一步的，上述核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：?步驟1）裁短設(shè)計，對apt-40原始鏈的特征序列進行二維結(jié)構(gòu)裁短設(shè)計，破壞原雙鏈莖結(jié)構(gòu)，使其自由能增加；所述的apt-40的特征序列為5′-cgt?gca?gta?cgc?caa?cct?ttc?tca?tgc?gct?gcc?cct?ctt?a-3′步驟2）分子對接模擬，通過分子對接模擬計算從步驟1）中篩選出與所述心肌肌鈣蛋白i結(jié)合能小于所述核酸適配體apt-40原始鏈的裁短特征序列，篩選所得特征序列為?apt-38、apt-36、apt-34中的任意一種；

7、步驟3）將步驟2）得到的含所述特征序列的所述核酸適配體與心肌肌鈣蛋白i結(jié)合，采用圓二色譜測試篩選出結(jié)合前后、在280?nm和250?nm附近的正特征峰和負(fù)特征峰存在最大變化值的核酸適配體。

8、上述核酸適配體用于分析檢測急性心肌梗死生物標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白i。

9、一種包含上述核酸適配體的電化學(xué)適配體傳感器。

10、進一步的，上述電化學(xué)適配體傳感器的結(jié)構(gòu)包括核酸適配體apt-36。

11、進一步的，上述電化學(xué)適配體傳感器在檢測心肌肌鈣蛋白i中的應(yīng)用。

12、進一步的，上述電化學(xué)適配體傳感器的應(yīng)用，包括以下步驟：

13、(1)電化學(xué)適配體傳感器的制備：將被硫醇化修飾的核酸適配體apt-36自組裝在納米多孔金電極表面，采用阻斷劑占據(jù)多余位點后沖洗干凈保存在ph?7.4磷酸鹽緩沖溶液中，所述被硫醇化修飾的核酸適配體apt-36為核酸適配體apt-36的兩端分別被二硫鍵和亞甲基藍(lán)基團修飾；

14、（2）基礎(chǔ)樣品測試，將步驟（1）中得到的所述電化學(xué)適配體傳感器作為工作電極與參比電極ag/agcl、對電極鉑絲一同放置于待測生物液體樣品溶液中，分別測試在低頻和高頻條件下不含心肌肌鈣蛋白i時的方波伏安電流信號iblank；

15、（3）濃度-響應(yīng)曲線建立，向步驟（2）系列所述待測生物液體樣品溶液中分批次加入心肌肌鈣蛋白i，并分別測試在低頻和高頻條件下心肌肌鈣蛋白i不同濃度下的所述待測生物液體樣品溶液的方波伏安電流信號itarget，將signal?gain?(s)?=(itarget–?iblank)/iblank×?100?%（1），定義為信號增益s；或，進一步的通過動力學(xué)差分kdm?signal?(d)?=s高頻–?s低頻（2），計算出不同濃度下的kdm?signal?，即d；根據(jù)所述信號增益s或所述kdm（d）與濃度的關(guān)系建立所述電化學(xué)適配體傳感器的濃度-響應(yīng)曲線；

16、標(biāo)定參數(shù)確定：對步驟（3）中得到的所述濃度-響應(yīng)曲線，用希爾方程（3）進行擬合，確定所述電化學(xué)適配體傳感器的標(biāo)定參數(shù)k1/2，ystart,?yend,?n；?所述希爾方程為：

17、

18、其中，y為s或d

19、未知樣品濃度測試：將步驟（4）得到的所述標(biāo)定參數(shù)k1/2，ystart,?yend，n再次代入這類所述電化學(xué)適配體傳感器的希爾方程中，重排后（4）即可對未知樣品濃度定量檢測；

20、

21、進一步的，上述步驟（1）中采用的所述阻斷劑可為6-巰基-1-己醇(mch)和2-巰基乙醇(mce)醇類巰基衍生物、鹽酸半胱胺(chc)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(dedtc)、牛血清白蛋白（bsa）中的任意一種。

22、本發(fā)明的技術(shù)原理為：

23、由于現(xiàn)有技術(shù)報導(dǎo)中篩選出心肌肌鈣蛋白i（ctni）的核酸適配體apt-40原始鏈有40個堿基，它的二級結(jié)構(gòu)自由能為-5.93?kcal/mol，架構(gòu)相對比較穩(wěn)定。針對該問題，對核酸適配體apt-40序列重新裁短設(shè)計，破壞核酸適配體的雙鏈莖的架構(gòu)，降低其穩(wěn)定性，以實現(xiàn)較大的構(gòu)象變化；在沒有靶標(biāo)存在的情況下，有利于核酸適配體展開狀態(tài)的形成，同時保留了對靶標(biāo)的識別和結(jié)合的能力，也增加核酸適配體與ctni結(jié)合時的構(gòu)象變化，適用于e-ab傳感器的制作。使用分子對接模擬和圓二色譜篩選與心肌肌鈣蛋白i結(jié)合后最穩(wěn)定以及構(gòu)象變化最大的適配體。

24、本發(fā)明的優(yōu)點在于：

25、1、篩選出的適配體apt-36制備的電化學(xué)適配體傳感器，具有高的pg/ml靈敏度，檢測限為1?pg/ml，滿足臨床檢測心肌梗死生物標(biāo)志物ctni濃度的需求（正常臨界值為0.03-0.13?ng/ml，>0.5?ng/ml可能為心肌梗死）。

26、2、此外，該傳感器操作簡便，臨床醫(yī)生甚至患者本人都可以檢測血液中的ctni，并在一分鐘內(nèi)快速得出結(jié)果，避免了漫長的等待時間和延誤對患者病情的診斷和治療。因此該傳感器有望實現(xiàn)臨床對急性心肌梗死的的早篩。