本發(fā)明屬于基因工程和廢棄物資源化領(lǐng)域，具體涉及高效代謝幾丁質(zhì)合成紫色桿菌素的工程菌株以及甲殼類廢棄物的高值生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。

背景技術(shù)：

1、全球每年產(chǎn)生近千萬噸甲殼類廢棄物，它們通常被填埋或者傾倒入海。這類廢棄物含有大量幾丁質(zhì)，是一種由n-乙酰氨基葡萄糖（glcnac）通過β-1，4-糖苷鍵組成的生物多聚糖。因此，甲殼類廢棄物進(jìn)入環(huán)境后會(huì)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、致病菌傳播等環(huán)境和健康問題。甲殼類廢棄物的不當(dāng)處置不僅導(dǎo)致環(huán)境污染，也會(huì)造成資源浪費(fèi)。實(shí)現(xiàn)甲殼類廢棄物的資源化利用為以上問題提供有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的解決途徑。

2、目前，較為成熟的甲殼類廢棄物資源化途徑是通過化學(xué)處理方法從廢棄物中提取幾丁質(zhì)，然后加工為殼聚糖產(chǎn)品。然而，該生產(chǎn)工藝需要消耗大量酸堿，獲得的殼聚糖異質(zhì)性高，限制了產(chǎn)品的應(yīng)用場景。盡管可以通過復(fù)雜的化學(xué)處理工藝將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為3-乙酰氨基-5-乙?；秽?、1-o-甲基-n-乙酰氨基葡萄糖等高值化合物，但是這種工藝受限于嚴(yán)苛的操作條件、巨大的能量消耗和試劑消耗而難以規(guī)模化生產(chǎn)。近年來快速發(fā)展的合成生物學(xué)技術(shù)有望解決上述挑戰(zhàn)。例如，研究者開發(fā)了利用機(jī)械化學(xué)耦合酶解及微生物合成的技術(shù)，將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為酪氨酸和多巴胺化合物。然而，機(jī)械球磨水解幾丁質(zhì)需要消耗大量電能，主要的水解產(chǎn)物是底盤微生物不能直接代謝利用的寡聚糖。轉(zhuǎn)化工藝的成本昂貴，因此難以規(guī)?；瘧?yīng)用。幾丁質(zhì)廢棄物亟需一種環(huán)保、綠色、高效的新型資源化技術(shù)。

3、紫色素桿菌具有一定的幾丁質(zhì)水解能力和高值生物活性物質(zhì)的合成能力，是實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)高值資源化轉(zhuǎn)化的理想底盤微生物。紫色素桿菌能夠合成生物色素紫色桿菌素（violacein），這是一種具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的高價(jià)值藥物分子，價(jià)值可達(dá)1600-2000元/mg。野生型紫色素桿菌生產(chǎn)紫色桿菌素普遍存在產(chǎn)量低、產(chǎn)量不穩(wěn)定等缺陷，制約了紫色桿菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是建立一種甲殼類廢棄物的新型資源化方法。降低甲殼類廢棄物資源化工藝的成本，提高資源化產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過對紫色素桿菌（chromobacteriumviolaceum）的基因工程改造，獲得了可以高效代謝幾丁質(zhì)合成紫色桿菌素的工程菌株，實(shí)現(xiàn)了廢棄幾丁質(zhì)向紫色桿菌素的全生物法高效轉(zhuǎn)化。

2、本發(fā)明提供了一株可高效代謝幾丁質(zhì)合成高值化合物的新型高產(chǎn)菌株。本發(fā)明選擇紫色素桿菌作為底盤微生物，通過基因工程改造，強(qiáng)化了底盤微生物利用幾丁質(zhì)作為唯一碳源和氮源代謝生長的能力，并顯著提升紫色素桿菌在幾丁質(zhì)作為唯一碳源和氮源時(shí)合成紫色桿菌素的產(chǎn)量。

3、本發(fā)明提供了紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，以野生型紫色素桿菌為出發(fā)菌，紫色素桿菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因過表達(dá)，所述紫色素桿菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。

4、本發(fā)明所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，使用阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和質(zhì)粒pyydt構(gòu)建。

5、本發(fā)明還提供了紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chivio，其特征在于，以野生型紫色素桿菌為出發(fā)菌，紫色素桿菌的cv_1440、cv_2935和cv_4240基因以及紫色桿菌素合成基因簇vioabcde過表達(dá)，所述紫色素桿菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分別如seq?idno.1、no.2和no.3所示，所述紫色桿菌素合成基因簇vioabcde序列如seq?id?no.5所示。

6、本發(fā)明所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chivio，其特征在于，使用阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和質(zhì)粒pyydt構(gòu)建。

7、本發(fā)明還提供了所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chi在水解幾丁質(zhì)和/或處理甲殼類廢棄物中的用途。

8、本發(fā)明還提供了所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chivio在水解幾丁質(zhì)和/或處理甲殼類廢棄物和/或合成紫色桿菌素中的用途。

9、本發(fā)明提供了利用幾丁質(zhì)和/或甲殼類廢棄物合成紫色桿菌素的方法，其特征在于，所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chi和/或所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chivio處理幾丁質(zhì)和/或甲殼類廢棄物。

10、本發(fā)明所述的利用幾丁質(zhì)和/或甲殼類廢棄物合成紫色桿菌素的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

11、（a）將所述幾丁質(zhì)和/或由所述甲殼類廢棄物獲得的幾丁質(zhì)作為碳源和/或氮源制備發(fā)酵培養(yǎng)液；和

12、（b）將所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chi和/或所述的紫色素桿菌工程菌株wt/pyydt-chivio轉(zhuǎn)接入幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃發(fā)酵。

13、本發(fā)明所述的利用幾丁質(zhì)和/或甲殼類廢棄物合成紫色桿菌素的方法還包括使用l-阿拉伯糖誘導(dǎo)處理。

14、本發(fā)明提供了一種利用上述新型工程菌株將甲殼類廢棄物高效合成紫色桿菌素的新型方法。該方法包括，利用預(yù)處理技術(shù)從甲殼類廢棄物中獲得幾丁質(zhì)，將幾丁質(zhì)作為上述新型工程菌株的唯一碳源和氮源，實(shí)現(xiàn)高價(jià)值化合物紫色桿菌素的高效合成。

15、本發(fā)明提供一套適用于紫色素桿菌的表達(dá)載體工具，增強(qiáng)工程菌株水解幾丁質(zhì)和合成紫色桿菌素的能力。所構(gòu)建的表達(dá)載體包括：

16、以pyydt質(zhì)粒載體，阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)，共表達(dá)關(guān)鍵幾丁質(zhì)酶和紫色桿菌素合成基因簇，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pyydt-chivio。從而獲得代謝幾丁質(zhì)合成紫色桿菌素的紫色素桿菌工程菌株。

17、在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述工程菌株的構(gòu)建方法包括：

18、（1）利用pcr擴(kuò)增紫色素桿菌基因組中的三種幾丁質(zhì)酶基因（cv_4240、cv_1440、cv_2935）和紫色桿菌素合成基因簇（cv_vioa、cv_viob、cv_vioc、cv_viod、cv_vioe）。并且，從pyydt質(zhì)粒擴(kuò)增含有阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子parabad的質(zhì)粒骨架dna片段，采用無縫克隆方法將這些基因片段整合為表達(dá)質(zhì)粒pyydt-chivio。

19、（2）將pyydt-chivio質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入紫色素桿菌中，獲得本發(fā)明的工程菌株wt/pyydt-chivio。

20、進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種將甲殼類廢棄物轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙珬U菌素的方法，包括如下步驟：

21、（1）從甲殼類廢棄物中提取幾丁質(zhì)。收集餐廚廢棄物螃蟹殼，清洗殼廢棄物之后干燥。經(jīng)過稀鹽酸、氫氧化鈉溶液、過氧化氫浸泡三輪預(yù)處理后，干燥幾丁質(zhì)并用磨粉機(jī)剪切為碎片。制備幾丁質(zhì)作為唯一碳源和氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液。

22、（2）將上述工程菌株培養(yǎng)至平臺(tái)期后，再轉(zhuǎn)接入幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)液中。在30℃培養(yǎng)四天后，可見白色幾丁質(zhì)被徹底水解，培養(yǎng)液紫色變深。離心收集菌體，用無水乙醇提取紫色桿菌素。

23、紫色素桿菌（chromobacterium?violaceum）包括atcc12472等菌株。

24、本發(fā)明能達(dá)到如下效果：

25、基因工程改造賦予底盤微生物將幾丁質(zhì)作為唯一碳源和氮源，維持生長代謝并合成紫色桿菌素的生物轉(zhuǎn)化能力，實(shí)現(xiàn)從無到有的新型資源化路徑。本發(fā)明使用合成生物學(xué)工具構(gòu)建基因工程菌株，成功實(shí)現(xiàn)在結(jié)晶型幾丁質(zhì)作為唯一碳源、氮源的培養(yǎng)基中生產(chǎn)紫色桿菌素，建立了一種綠色、高效、低成本的幾丁質(zhì)廢棄物新型資源化方法。

26、本技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，提升了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的價(jià)值；其次，以一種溫和、綠色的方式實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)的資源化轉(zhuǎn)化；再次，為廢棄物提供經(jīng)濟(jì)可行的資源化辦法，避免廢棄物隨意處置過程中導(dǎo)致的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)；最后，拓寬了微生物生產(chǎn)紫色桿菌素的底物類型。隨著工藝改進(jìn)，從廢棄物中提取幾丁質(zhì)的成本降低、品質(zhì)提升，幾丁質(zhì)有望為微生物發(fā)酵生產(chǎn)提供廉價(jià)的營養(yǎng)源。