本發(fā)明屬于腔前卵泡分離培養(yǎng)，尤其涉及一種豬卵巢腔前卵泡的分離與培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、卵泡是哺乳動(dòng)物卵巢上的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，是性激素合成的中心，是卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境。卵泡腔形成是腔前卵泡發(fā)育最為關(guān)鍵的階段之一，絕大部分卵泡會(huì)在此階段發(fā)生閉鎖退化。研究表明，在哺乳動(dòng)物的卵巢皮質(zhì)上，卵泡成腔前的生長期發(fā)生閉鎖非常低。但腔前卵泡至成熟卵泡這一階段，99％以上的腔前卵泡發(fā)生閉鎖退化。大量的腔前卵泡發(fā)生閉鎖退化造成卵母細(xì)胞的利用效率低下，同時(shí)不利于優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的篩選。若將這些具備發(fā)育潛力的腔前卵泡分離出，在體外適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，就可以避免卵母細(xì)胞資源的浪費(fèi)。

2、建立體外培養(yǎng)系統(tǒng)，利用成分明確的限定培養(yǎng)基培養(yǎng)腔前卵泡并獲得具備受精與胚胎發(fā)育能力的卵母細(xì)胞，是完善卵泡發(fā)生體外研究模型的關(guān)鍵。豬卵泡基質(zhì)組織因存在粘連較多、分離較困難、培養(yǎng)周期較長、質(zhì)量不均一等問題，研究比較緩慢。1994年，hirao等將豬腔前卵泡體外包埋培養(yǎng)16d獲得具備受精能力的成熟卵母細(xì)胞，但是受精卵不能形成雄原核。2001年wu等對豬腔前卵泡4d貼壁培養(yǎng)，經(jīng)ivf與卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)，首次獲得囊胚。2010年hashimoto等證明豬早期有腔卵泡來源顆粒-卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)體外培養(yǎng)同樣能夠得成熟卵母細(xì)胞。2015年楊宏星等通過體外分離腔前顆粒-卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)18.5d，成腔率為40.0％，卵母細(xì)胞成熟率達(dá)到26.2％。然而，目前完整的豬腔前卵泡分離培養(yǎng)體系未見報(bào)道。由于豬卵巢結(jié)締組織連接緊密，通過簡單的剝離無法分離出卵泡，因此豬腔前卵泡分離體系需要進(jìn)一步改進(jìn)，培養(yǎng)體系需要完善。綜上可知，豬卵泡體外分離培養(yǎng)的研究仍存在分離方法效率低、完整卵泡無法體外培養(yǎng)、培養(yǎng)成分待明確等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種豬卵巢腔前卵泡的分離方法，具有提高腔前卵泡體外分離效率的優(yōu)勢。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬卵巢腔前卵泡的三維培養(yǎng)方法，具有使完整豬腔前卵泡體外成腔的優(yōu)勢。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

4、本發(fā)明提供了一種豬卵巢腔前卵泡的分離方法，包括如下步驟：將豬卵巢組織碎塊與卵泡分離液混合消化0.5-2h，棄上清，終止消化，得消化組織；將消化組織過400μm網(wǎng)篩，得腔前卵泡；所述卵泡分離液由l-15培養(yǎng)基、2mg/ml膠原蛋白酶ⅰ、200μg/ml?dnase?i(脫氧核糖核酸酶i)和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

5、優(yōu)選的，所述豬卵巢組織碎塊的粒徑小于1mm2。

6、優(yōu)選的，所述豬卵巢組織碎塊與卵泡分離液的體積比為1：2。

7、優(yōu)選的，所述混合消化的溫度為37.5℃，在混合消化的過程中每20-30min震蕩10秒。

8、優(yōu)選的，所述終止消化的方式為加入卵泡清洗液，所述卵泡清洗液由l-15培養(yǎng)基、10％fbs(胎牛血清)和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

9、本發(fā)明還提供了一種豬卵巢腔前卵泡的培養(yǎng)方法，在上述分離方法的基礎(chǔ)上，還包括如下步驟：將獲得的腔前卵泡與海藻酸鈉溶液混合后，再與cacl2溶液混合，將包被好的腔前卵泡與培養(yǎng)基混合培養(yǎng)。

10、優(yōu)選的，所述海藻酸鈉溶液的濃度為1％。

11、優(yōu)選的，所述cacl2溶液的濃度為100mm。

12、優(yōu)選的，所述與cacl2溶液混合的時(shí)間為1-2min。

13、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)用的培養(yǎng)基由dmem/f12培養(yǎng)基、10％fbs、1μg/ml10×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(its-g)、100miu/ml促卵泡激素(fsh)和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

14、本發(fā)明的有益效果：

15、本發(fā)明提供的豬卵巢腔前卵泡的分離與培養(yǎng)方法對豬腔前卵泡分離和體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，達(dá)到了提高腔前卵泡體外分離效率、使完整豬腔前卵泡體外成腔的顯著技術(shù)效果。不僅能夠?yàn)樨i胚胎工程研究與應(yīng)用提供充足的卵源，而且為進(jìn)一步挖掘豬的遺傳潛力提供了借鑒。

技術(shù)特征：

1.一種豬卵巢腔前卵泡的分離方法，其特征在于，包括如下步驟：將豬卵巢組織碎塊與卵泡分離液混合消化0.5-2h，棄上清，終止消化，得消化組織；將消化組織過400μm網(wǎng)篩，得腔前卵泡；所述卵泡分離液由l-15培養(yǎng)基、2mg/ml膠原蛋白酶ⅰ、200μg/ml?dnase?i和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述豬卵巢組織碎塊的粒徑小于1mm2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述豬卵巢組織碎塊與卵泡分離液的體積比為1：2。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述混合消化的溫度為37.5℃，在混合消化的過程中每20-30min震蕩10秒。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述終止消化的方式為加入卵泡清洗液，所述卵泡清洗液由l-15培養(yǎng)基、10％fbs和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

6.一種豬卵巢腔前卵泡的培養(yǎng)方法，其特征在于，在權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述分離方法的基礎(chǔ)上，還包括如下步驟：將獲得的腔前卵泡與海藻酸鈉溶液混合后，再與cacl2溶液混合，將包被好的腔前卵泡與培養(yǎng)基混合培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液的濃度為1％。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述cacl2溶液的濃度為100mm。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述與cacl2溶液混合的時(shí)間為1-2min。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)用的培養(yǎng)基由dmem/f12培養(yǎng)基、10％fbs、1μg/ml?10×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、100miu/ml促卵泡激素和1％青霉素-鏈霉素溶液組成。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種豬卵巢腔前卵泡的分離與培養(yǎng)方法，屬于腔前卵泡分離培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用機(jī)械?酶復(fù)合法分離豬腔前卵泡，采用海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)包被三維培養(yǎng)法進(jìn)行腔前卵泡的體外培養(yǎng)。本發(fā)明豬卵巢腔前卵泡的分離方法包括如下步驟：將豬卵巢組織碎塊與卵泡分離液混合消化0.5?2h，棄上清，終止消化，將消化組織過400μm網(wǎng)篩，得腔前卵泡。本發(fā)明對豬腔前卵泡分離和體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，達(dá)到了提高腔前卵泡體外分離效率、實(shí)現(xiàn)腔前卵泡體外成腔培養(yǎng)的效果。不僅能夠?yàn)樨i胚胎工程研究與應(yīng)用提供充足的卵源，而且為進(jìn)一步挖掘豬的遺傳潛力提供了借鑒。

技術(shù)研發(fā)人員：褚瑰燕,蔡傳江,張璐通,時(shí)勝潔,李億豪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北農(nóng)林科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2