本發(fā)明涉及酶催化，具體涉及一種具有高活性糖苷酶及其在人參皂苷rd制備中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、糖基轉(zhuǎn)移酶在改善天然產(chǎn)物成藥性以及催化轉(zhuǎn)化方面有著重要的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)稀有人參皂苷可由來源豐富的皂苷分子水解去掉糖基獲得。酶法轉(zhuǎn)化具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高、轉(zhuǎn)化過程可控等優(yōu)點(diǎn)，是制備稀有人參皂苷的較為理想的手段。不同性質(zhì)的酶作用于不同構(gòu)型、不同組成的糖苷鍵，從而可以定向形成目的產(chǎn)物。利用來源于米曲霉的半乳糖苷酶和青霉菌的乳糖酶粗酶液，三醇型皂苷混合物可水解產(chǎn)生人參皂苷rg2和rh1。利用柚皮苷酶粗酶液可以水解三醇型皂苷混合物產(chǎn)生腸道菌代謝產(chǎn)物f1和20(s)-ppt。二醇型皂苷混合物經(jīng)乳糖酶、β-半乳糖苷酶和纖維素酶粗酶液可以分別轉(zhuǎn)化為f2、ck和rd，經(jīng)乳糖酶粗酶液則可轉(zhuǎn)化產(chǎn)生rd、rg3和ck。利用黑曲霉粗糖苷酶可以將r-rg3和rf分別轉(zhuǎn)化為ppd(s，r)和20(s)-ppt，轉(zhuǎn)化率分別為100％和90.4％。利用人參皂苷β-葡萄糖苷酶，從人參二醇型皂苷生產(chǎn)rh2，轉(zhuǎn)化率60％以上，rh2純度可達(dá)90％，反應(yīng)后酶回收率達(dá)60％。

2、現(xiàn)有技術(shù)酶法轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷，通常需要在偏離中性的緩沖液體系中進(jìn)行，緩沖鹽的使用造成后續(xù)處理困難及環(huán)境問題。本發(fā)明從黑曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離出一種糖苷酶，并進(jìn)行了蛋白測(cè)序，用于轉(zhuǎn)化制備人參皂苷rd，可以在中性非緩沖體系進(jìn)行，具有酶活性好、工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、成本低、人參皂苷rd轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，適于規(guī)?；苽?。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種糖苷酶，并應(yīng)用該糖苷酶進(jìn)行人參皂苷rd的制備，解決了目前人參皂苷酶催化轉(zhuǎn)化制備過程使用大量緩沖鹽、步驟繁瑣、料液處理量小等問題。本發(fā)明的糖苷酶及其制備方法，較現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的有益效果:

2、本發(fā)明從黑曲霉菌(aspergillusniger，cicc菌種保藏編號(hào)2238)的發(fā)酵產(chǎn)物中，首次發(fā)現(xiàn)一種能夠在中性非緩沖體系中催化人參皂苷rb1高效轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd的糖苷酶，轉(zhuǎn)化率可達(dá)71％以上。

3、本發(fā)明公開了一種糖苷酶及其在人參皂苷rd制備中的應(yīng)用。所述酶的氨基酸序列包括：(1)seq?id?no.1所示的序列，或，(2)利用本領(lǐng)域通用技術(shù)手段對(duì)seq?id?no.1所示序列進(jìn)行取代、缺失或添加一個(gè)或至少兩個(gè)氨基酸殘基改造而獲得的酶，且具有與(1)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列。

4、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、一種糖苷酶及其在人參皂苷rd制備中應(yīng)用，所述糖苷酶的氨基酸序列如seq?idno.1所示。

6、seq?id?no.1：

7、dsqlkssqngvgvkltaypecssdtlstypaalsavvanldstvsdsengvvgklvrpdg

8、vggvhldnhkwtsssvlgnptvfnsatecyatsctfsgsegassaskygspscstivlsdv

9、avpsgttldltdlndgthvifegettfnykpsgplvsvsgtditvtgadgaylngdgsrw

10、wdgegsnggktkpkffyahdltsstisgiyiqnspvqvfsidgstytmeditidngpalvga

11、antdgfdigdstyititganvynqddcvavnsgeniyfsggvcsgghglsigsvggrsdnt

12、vknvtfydseikssqngvriktiygdtgsvsevtykeitlsditdygivveqnyddtsksptd

13、gitiedfvldnvqgsvessgtniyivcgsdsctdwtwtdvdvsggktssdcenvpddisc

14、一種糖苷酶及其在人參皂苷rd制備中應(yīng)用，其特征在于，以人參提取物為原料，催化轉(zhuǎn)化制備人參皂苷rd。

15、進(jìn)一步地，所述催化轉(zhuǎn)化制備包括以下步驟：

16、向反應(yīng)容器中加入一定濃度的人參提取物水溶液，按料酶比加入糖苷酶溶液，在一定溫度條件下轉(zhuǎn)化一定時(shí)間。轉(zhuǎn)化完成后，加至預(yù)處理好的d101大孔樹脂柱，水洗，回收酶溶液，70％含水乙醇洗脫，洗脫液濃縮，干燥即得。

17、進(jìn)一步地，所述催化轉(zhuǎn)化步驟中人參提取物濃度為1～36.36mg/ml；

18、進(jìn)一步地，所述催化轉(zhuǎn)化步驟中料酶比為1:1～1:2.5；

19、進(jìn)一步地，所述催化轉(zhuǎn)化步驟中溫度為45～60℃；

20、進(jìn)一步地，所述催化轉(zhuǎn)化步驟中轉(zhuǎn)化時(shí)間為1.5～6h；

21、進(jìn)一步地，所述人參皂苷rd轉(zhuǎn)化率為37.75～71.2％。

22、本發(fā)明公開了一種糖苷酶及其在人參皂苷rd制備中的應(yīng)用。該糖苷酶氨基酸序列包括seq?id?no.1所示的序列，或?qū)eq?id?no.1所示序列進(jìn)行取代、缺失或添加一個(gè)或至少兩個(gè)氨基酸殘基改造、具有相同或相似功能的氨基酸序列的酶。該糖苷酶催化含有底物人參皂苷rb1的復(fù)雜料液，在中性非緩沖體系中轉(zhuǎn)化制備人參皂苷rd，酶活性好，工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，人參皂苷rd轉(zhuǎn)化率可達(dá)71％以上，適合規(guī)模化制備，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)特征：

1.一種糖苷酶，其特征在于，所述糖苷酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，以人參皂苷rb1為底物，在糖苷酶的催化下制備產(chǎn)物人參皂苷rd；其中，所述糖苷酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:a向反應(yīng)容器中加入一定濃度的人參提取物水溶液，按料酶比加入糖苷酶溶液，在一定溫度條件下轉(zhuǎn)化一定時(shí)間；b轉(zhuǎn)化完成后，加至預(yù)處理好的d101大孔樹脂柱，水洗，回收酶溶液，70％含水乙醇洗脫，洗脫液濃縮，干燥即得。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，所述人參提取物濃度為1～36.36mg/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，所述料酶比為1:1～1:2.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，所述溫度為45～60℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化時(shí)間為1.5～6h。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參皂苷rd的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)物人參皂苷rd轉(zhuǎn)化率為37.75％～71.2％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種糖苷酶及其在人參皂苷Rd制備中的應(yīng)用。該糖苷酶氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.1所示的序列。該糖苷酶催化含有人參皂苷Rb1的復(fù)雜料液，在中性非緩沖體系中轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd，酶活性好，工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化率可達(dá)71％以上，適合規(guī)模化制備，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)研發(fā)人員：魏英勤,王美玲,王軼男,王曉,房海燕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2