本發(fā)明涉及酶工程和生物，具體地，涉及一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體及其編碼基因、重組載體、重組菌株、酶制劑以及它們在水解黃芪甲苷為環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、β-木糖苷酶是來自gh3家族的水解酶，其能夠水解β-d-木糖苷末端非還原木糖殘基的β-1，4-木糖苷鍵，并釋放出木糖。其主要存在于細(xì)菌和真菌之中，常見于絲狀真菌。β-木糖苷酶不僅具有轉(zhuǎn)糖苷功能；還具有催化糖苷鍵斷裂、高效水解糖基的能力?；谄涔δ艿亩鄻有?，β-木糖苷酶在食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保方面已得到廣泛應(yīng)用，如在能源領(lǐng)域中，可與纖維素酶和果膠酶配合使用，從植物半纖維素中提取的木糖生產(chǎn)生物乙醇。在食品領(lǐng)域中β-木糖苷酶幫助啤酒生產(chǎn)，降低啤酒的濁度。β-木糖苷酶也可以用于轉(zhuǎn)化許多具有生物活性的化合物，從而獲得更具有價值、更容易利用的活性物質(zhì)，如人參皂苷rb3、三七皂苷、朝藿定b和花青素等。

2、原核表達(dá)系統(tǒng)由于缺乏翻譯后修飾功能而導(dǎo)致所得蛋白往往不具有活性，而畢赤酵母是目前繼大腸桿菌之后最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，其遺傳背景較為清晰，且具有翻譯后修飾系統(tǒng)，并在培養(yǎng)過程無毒素生成，適合應(yīng)用于食品工業(yè)中的酶的重組表達(dá)。

3、環(huán)黃芪醇屬于三萜皂苷類化合物。其具有抑制腦缺血時腦細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥、維持血腦屏障等作用，是抗衰老藥物研發(fā)中的熱門分子。同時，環(huán)黃芪醇是現(xiàn)今唯一發(fā)現(xiàn)的端粒酶活性劑。其主要由黃芪甲苷水解得到，而目前傳統(tǒng)的合成方法中，植物提取法易受外界環(huán)境影響，提取的有效成分含量低，且培養(yǎng)過程中易受污染；而環(huán)黃芪醇具有一定的酸不穩(wěn)定性，易在酸性條件下轉(zhuǎn)化為黃芪醇，因此酸水解法產(chǎn)率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。酶法合成環(huán)黃芪醇具有條件溫和、反應(yīng)專一且高效的特點，可以較好解決植物提取法以及化學(xué)合成法所存在的問題。然而現(xiàn)有的黃芪甲苷木糖苷鍵水解酶活性有限，如何挖掘出高催化活性的水解酶，從而提高環(huán)黃芪醇的生產(chǎn)效率，成為亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的黃芪甲苷木糖苷鍵水解酶活性有限，催化效率低的問題，提供一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體及其編碼基因、重組載體、重組菌株和酶制劑以及它們的應(yīng)用，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體具有較高的催化效率。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體為將具有seq?id?no.1所示氨基酸序列的第23位、第699位、第712位中的至少一位進(jìn)行突變。

3、優(yōu)選地，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體為將具有seq?id?no.1所示氨基酸序列的酶進(jìn)行(1)-(3)中至少一種所述的突變；

4、(1)第23位半胱氨酸c突變?yōu)樘K氨酸t(yī)，以c23t表示；

5、(2)第699位蘇氨酸t(yī)突變?yōu)榻j(luò)氨酸y，以t699y表示；

6、(3)第712位天冬氨酸d突變?yōu)榱涟彼醠，以d712l表示。

7、優(yōu)選地，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體為將具有seq?id?no.1所示氨基酸序列的酶進(jìn)行(1)中所述的突變。

8、本發(fā)明第二方面提供一種編碼黃芪甲苷β-糖苷酶突變體的基因，該基因具如前所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的核苷酸序列。

9、優(yōu)選地，所述編碼黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的基因的核苷酸序列如seq?idno.23所示。

10、本發(fā)明第三方面提供一種重組載體，所述重組載體含有如前所述的基因。

11、優(yōu)選地，該表達(dá)載體為ppic9k質(zhì)粒。

12、本發(fā)明第四方面提供一種重組菌株，所述重組菌株含有如前所述的基因或者如前所述的重組載體。

13、本發(fā)明第五方面提供一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的制備方法，該方法包括：將如前所述的重組菌株接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

14、本發(fā)明第六方面提供一種酶制劑，該酶制劑包含如前所述的方法制得的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體。

15、本發(fā)明第七方面提供如前所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體、如前所述的基因、如前所述的重組載體、如前所述的重組菌株、如前所述的方法制得的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體和如前所述的酶制劑中的至少一種在水解黃芪甲苷為環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷的應(yīng)用。

16、本發(fā)明第八方面提供如前所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體、如前所述的基因、如前所述的重組載體、如前所述的重組菌株、如前所述的方法制得的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體和如前所述的酶制劑中的至少一種在水解黃芪甲苷為環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷的方法。

17、優(yōu)選的，所述黃芪甲苷以濃度為1-5g/l的溶液形式進(jìn)行所述混合。

18、優(yōu)選地，相對于1g黃芪甲苷，黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的用量為0.3u—0.5u。

19、優(yōu)選地，該反應(yīng)的條件包括：ph為4-5，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為30-50℃。

20、通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過基因狩獵法挖掘得到來源于aspergillusaculeatus的黃芪甲苷β-木糖苷酶序列，并成功實現(xiàn)了在酵母中的異源表達(dá)，構(gòu)建獲得水解活性提高的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體，相較于野生型，其催化活性更高，水解黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化率更高，使酶催化黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷的效率顯著提高。

21、本發(fā)明提供的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體在制備環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷中具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體，其特征在于，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體為將具有seq?id?no.1所示氨基酸序列的第23位、第699位、第712位中的至少一位進(jìn)行突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體，其特征在于，該黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體為將具有seq?id?no.1所示氨基酸序列的酶進(jìn)行(1)-(3)中至少一種所述的突變；

3.一種編碼黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的基因，其特征在于，該基因具有編碼權(quán)利要求1或2所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的核苷酸序列；

4.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求3所述的基因；

5.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株含有權(quán)利要求3所述的基因或者權(quán)利要求4所述的重組載體；

6.一種黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體的制備方法，其特征在于，該制備方法包括：將權(quán)利要求5所述的重組菌株接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

7.一種酶制劑，其特征在于，該酶制劑包含權(quán)利要求6所述的方法制得的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體。

8.權(quán)利要求1或2所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求4所述的重組載體、權(quán)利要求5所述的重組菌株、權(quán)利要求6所述的方法制得黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體和權(quán)利要求7所述的酶制劑中的至少一種在水解黃芪甲苷為環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷的運用。

9.一種黃芪甲苷的水解方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求1或2所述的黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求4所述的重組載體、權(quán)利要求5所述的重組菌株、權(quán)利要求6所述的方法制得黃芪甲苷β-木糖苷酶突變體和權(quán)利要求7所述的酶制劑中的至少一種，與黃芪甲苷混合進(jìn)行反應(yīng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的黃芪甲苷的水解方法，其特征在于，所述反應(yīng)的產(chǎn)物為環(huán)黃芪醇-6-o-葡萄糖苷；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于酶工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種黃芪甲苷β?木糖苷酶突變體及其編碼基因、重組載體、重組菌株、酶制劑和應(yīng)用。所述突變體的氨基酸序列是由SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列的第23位、第699位、第712位中的至少一位進(jìn)行突變，該黃芪甲苷β?木糖苷酶突變體酶催化活性、水解轉(zhuǎn)化率顯著提高，使酶催化黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇?6?O?葡萄糖苷的生產(chǎn)效率顯著提高，具有較好的工業(yè)化潛能。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭媛元,劉宇,薛鋒,徐晴
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6